[发明专利]一种马立克氏病毒的悬浮培养方法

权利要求书

1.一种马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：

1)鸡胚源DF-1细胞系的传代与培养：以鸡胚源DF-1细胞系作为制备病毒用细胞；将鸡胚源DF-1细胞经胰酶-EDTA细胞分散液消化成单个均匀细胞，然后置于细胞生长液继续培养，当细胞长成单层时，用于继续传代或接种病毒；

2)细胞毒种的繁殖：用稀释液将马立克氏病毒种稀释，将病毒和经步骤1)处理的DF-1细胞一起接入含细胞培养液的培养瓶中进行培养，当细胞病变时收获细胞毒作为毒种；

3)制苗用病毒的吸附培养：将从步骤2)得到的毒种稀释为病毒液，将病毒和新的鸡胚源DF-1细胞一起接入含有微载体和悬浮培养液的培养瓶中，进行悬浮吸附培养；

4)病毒的增殖培养及收获：弃去悬浮培养液，加入病毒增殖培养液进行悬浮增殖培养；当接入的细胞病变率达80％以上时，收获病毒液并保存。

2.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，所述马立克氏病毒为马立克氏病血清Ⅰ型CVI988/Rispens株、814株、血清Ⅱ型SB-1株、血清Ⅲ型火鸡疱疹病毒Fc-126株中的至少一种。

3.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤2)中，接种病毒的感染复数为0.001-1。

4.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤3)中，所述悬浮培养液为含体积百分比5-10％新生牛血清的DMEM/F12培养基。

5.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤3)中，所述培养瓶中的微载体和细胞的个数之比为1:50～250。

6.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤3)中，所述微载体的浓度为1-5g/L。

7.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤3)中，所述悬浮吸附培养的时间为12-48h；培养温度为36～38℃。

8.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述的病毒增殖培养液为含体积百分比2％新生牛血清的DMEM/F12培养基。

9.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤4)中，所述悬浮增殖培养的时间为24-72h；培养温度为36～38℃。

10.如权利要求1所述的马立克氏病毒的悬浮培养方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)中，在培养的过程中对培养液进行搅拌；搅拌的方式为间歇搅拌或连续搅拌；搅拌速度为20-50RPM。