[发明专利]用于水产动物源细菌磺胺类药物耐药基因三重荧光定量PCR检测的引物、探针及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于磺胺类药物耐药基因检测技术领域，尤其涉及用于水产动物源细菌磺胺类药物耐药基因三重荧光定量PCR检测的引物、探针及其使用方法。

背景技术

细菌性疾病是中国水产养殖动物的主要病害，其造成水产养殖动物的损失占全部病害损失的50％以上。在水产养殖过程中，使用各种抗菌素类药物抑制或者杀灭致病菌是防治水产养殖动物细菌性疾病最有效的手段。磺胺类药物作为主要的渔用抗菌药具有抗菌谱广、药效显著、价格低、易储存等优点，是目前各水产养殖场的必备药物。国内大量研究结果表明，水产动物源细菌对磺胺类药物已经产生了广泛的耐药性。临床上细菌对磺胺类药物的抗性主要是由质粒上对磺胺类药物亲和力更低的新二氢叶酸合成酶(即具有抗性的DHPS)所介导，且耐药质粒可通过转化、易位、接合等方式在细菌之间进行转移，使R^-细菌从R⁺细菌中获得这种抗性。对磺胺类药物具有抗性的DHPS共有3种，其对应的编码基因分别被命名为Sul1、Sul2和Sul3，对这3个基因的检测能反映细菌对磺胺类药物的耐药情况。

中国目前临床上对细菌磺胺类药物耐药性的检测主要采用传统的药敏试验方法，这些方法耗时长、准确性差、灵敏度低、稳定性不强，已不能满足临床上快速、准确筛选敏感药物的需要。鉴于此，国内已有学者将PCR技术应用于磺胺类药物耐药性的快速检测和耐药基因的分子流行病学调查。荧光定量PCR不仅有常规PCR技术扩增效率高的特点，还具有探针的高度特异性、光谱技术的高敏感性和精确性等特点，且能定量，不易受到污染，被广泛运用于医疗、药物研究及病原菌检测。多重PCR技术能够在一个PCR体系中同时检测多个目标基因，其快速、高效及低成本等特点具有十分广泛的应用前景。目前，有关磺胺类药物耐药基因荧光定量PCR检测方法的报道尚少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供用于水产动物源细菌磺胺类药物耐药基因三重荧光定量PCR检测的引物、探针及其使用方法，以实现快速、简便、准确地进行磺胺类药物耐药性的快速检测和耐药基因的调查提供技术支持。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

用于水产动物源细菌磺胺类药物耐药基因三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别针对水产动物源细菌磺胺类药物耐药基因Sul1、Sul2和Sul3的三组引物和探针，三组引物和探针分别具有以下碱基序列：

Sul1-F CTCGGTGTCGCGGAAATC，

Sul1-R CGCTGGACCCAGATCCTTT，

Sul1-P CGCCACCGTTGGCCTTCCTG；

Sul2-F TGGTGTGGCCTATCTCAATGAT，

Sul2-R GGCAGATGATTTCGCCAATT，

Sul2-P TTCGCGGTTTTCCAGACGCTGC；

Sul3-F CAACGCCCACTTCAGTTGTATC，

Sul3-R TCTGCATTTGGTTGAAGATGGA，

Sul3-P AAGCGGCTCCCAAATCAATCACATCTG。

探针Sul1-P、Sul2-P、Sul3-P的5’端分别标记有荧光报告基团FAM、HEX、CY5，3’端均标记有荧光淬灭基团BHQ1。

三组引物和探针的摩尔比为Sul1-F∶Sul1-R∶Sul1-P∶Sul2-F∶Sul2-R∶Sul2-P∶Sul3-F∶Sul3-R∶Sul3-P＝6∶6∶3∶4∶4∶2∶4∶4∶2。

上述用于水产动物源细菌磺胺类药物耐药基因三重荧光定量PCR检测的引物和探针的使用方法，在三重荧光定量PCR中扩增水产动物源细菌磺胺类药物耐药基因Sul1、Sul2和Sul3。

三重荧光定量PCR的反应体系和反应程序为：

反应体系为：Premix Ex Taq(2×)18μL，ROX Reference Dye II 0.5μL，20μmol/L Sul1上、下游引物(Sul1-F/Sul1-R)均为0.9μL，10μmol/L Sul1探针(Sul1-P)用量为0.9μL，20μmol/L Sul2和Sul3的上、下游引物(Sul2-F/Sul2-R、Sul3-F/Sul3-R)均为0.6μL，10μmol/L Sul2和Sul3探针(Sul2-P、Sul3-P)用量均为0.6μL，模板3μL，用灭菌ddH₂O补足至30μL；