[发明专利]基于无细胞DNA的癌症早期诊断试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于无细胞DNA的癌症早期诊断试剂盒及其应用，属于医药生物检测领域。

背景技术

无细胞DNA又称循环DNA，是指一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中。随着生物技术的发展，肿瘤临床的早期诊断、鉴别诊断、有效观察及预后检测越来越受益于肿瘤分子标记的发现及其检测方法的完善。目前认为无细胞DNA是一种无侵袭性的潜在用途较大的肿瘤标志物。

目前关于无细胞DNA产生的生物学机制尚无定论，但是目前认为无细胞DNA可能来源于细胞凋亡或坏死后释放的DNA片段，这些片段通过毛细血管壁或淋巴管管壁渗透到血循环中；也可能来源于有核细胞裂解释放的DNA片段，外周血中存在结构完整的肿瘤细胞，肿瘤细胞裂解后产生的DNA片段占游离DNA片段的大部分。研究表明各种肿瘤患者体内的循环血中均存在肿瘤细胞，但这些细胞不是转移的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞在外周血中在吞噬细胞的作用下裂解释放出DNA片段，即无细胞DNA。

无细胞DNA检测包括：突变位点检测、常甲基化检测以及杂合性缺失检测等，但是这些检测均需要较为复杂的分子生物学手段才能获得结果，并且这些结果准确度较差。一般来讲，直接定量人体体液中无细胞DNA是一种较好的检测手段，但是由于无细胞DNA以低浓度(0.2至200ng/ml)存在于血清、血浆和其它体液(即尿、腹水等)且高度降解(Wang等，2003，Cancer Res.，63(14)：3966-8)，因此本领域中很难通过常规手段直接定量无细胞DNA而获得相关检测结果，尤其是对于患有早期癌症的患者来说，目前的检测手段很难通过定量无细胞DNA将正常个体与患有早期癌症的患者区别开。

发明内容

出人意料的是，本发明发现当对人体施用一定量的化合物或组合物后，患有早期肿瘤的患者体液中源于肿瘤的无细胞DNA含量会急剧升高，而正常个体的无细胞DNA含量却无明显变化。

本发明的目的之一是提供一种基于无细胞DNA定量检测的癌症早期诊断试剂盒，其包括具有提高人体免疫力的化合物或组合物以及定量检测人体体液中无细胞DNA的相关试剂。

在一个实施方案中，所述具有提高人体免疫力的化合物或组合物包括但不限于：树突细胞疫苗、免疫检查点抑制剂、具有提高人体内CD4+和CD8+T细胞比例的化合物以及具有免疫激活或免疫增强作用的中药。进一步地，所述具有提高人体免疫力的化合物或组合物为免疫检查点抑制剂。

在另一个实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、PD1阻断剂、抗PD1抗体、LAG-3抑制剂、PD-L1阻断剂、抗PD-L1抗体、B7-H3抑制剂、B7-H4抑制剂和/或TIM3抑制剂。

在一个具体地实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(MDX-D010)；所述PD1阻断剂是尼沃鲁单抗(nivolumab)、兰伯丽珠单抗(lambrolizumab)、CT-011和/或AMP-224；PD-L1阻断剂是BMS-936559；所述LAG-3抑制剂是IMP321；所述B7-H3抑制剂是MGA271。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是一种下调T细胞活化路径的免疫检查点蛋白(Fong等人,Cancer Res.69(2):609-615,2009；Weber Cancer Immunol.Immunother,58:823-830,2009)。经显示，阻断CTLA-4可增进T细胞活化和增殖。CTLA-4抑制剂包括抗CTLA-4抗体。抗CTLA-4抗体结合到CTLA-4并且阻断CTLA-4与它在抗原呈递细胞上表达的配体CD80/CD86的相互作用，并由此阻断由这些分子相互作用引起的免疫反应的负面下调。抗CTLA-4抗体的实例描述于美国专利号：5811097、5811097、5855887、6051227、6207157、6682736、6984720及7605238中。一种抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(替西木单抗(ticilimumab)，CP-675206)。在一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(又称10D1，MDX-D010)，一种结合到CTLA-4的完全人类单克隆IgG抗体。伊匹单抗是以YervoyTM的名称销售并且已经被批准用于治疗无法切除或转移性黑色素瘤。