[发明专利]一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途

说明书

一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途，涉及海洋软体动物细胞培养。设有包装盒、洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书；洗液I瓶、洗液II瓶、洗液III瓶、溶液A瓶、溶液B瓶、溶液C瓶、使用说明书设在包装盒内。试剂盒在多种海洋软体动物多种体细胞的无菌分离与体外原代培养中应用。通过对海洋软体动物细胞分离和原代培养的条件进行优化，获得适合海洋软体动物细胞分离与原代培养适合条件，解决现有技术无法实现的海洋软体动物细胞快速分离与原代细胞无菌培养体系快速建立的问题，建立海洋软体动物原代细胞快速分离与原代细胞无菌方法，给出海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒。

技术领域

本发明涉及海洋软体动物细胞培养，尤其是涉及一种海洋软体动物原代细胞分离与培养试剂盒及其用途。

背景技术

细胞培养是现代生物工程技术中的重要技术与常用方法之一，广泛应用于细胞代谢、基因转录、蛋白质表达、细胞环境应急与免疫机制、药物筛选与生物药物表达生产等研究领域。在植物、哺乳动物、鱼类和昆虫的研究中，细胞与组织培养已经成为不可或缺的研究手段，特别是在相关基因表达调控机制、细胞信号转导通路、细胞环境应激机制、以及遗传与突变研究等方面，细胞培养已经成为无法替代的手段，也是促进现代生物技术快速发展的重要技术。但是，在海洋软体动物细胞培养领域，因为海洋软体动物细胞形态、功能分化、结构与营养需求等方面的特殊性，至今仍然没有建立起永生细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法([1]Villena AJ.Rev Fish Biol Fish,2003,13:111；[2]李建军，黄宝玉.海洋通报,2015(3):247-251)。然而，即使是原代细胞培养，目前可选择用于海洋软体动物细胞分离与原代培养的试剂盒相关产品依然十分有限，严重影响了海洋软体动物细胞学相关研究与应用技术的发展。

软体动物因为应用广泛，其细胞培养研究是无脊椎动物中开展的最早最广泛的，培养对象包括一些养殖的经济贝类，组织细胞包括胚胎、鳃、外套膜、血细胞和心肌等多种组织来源。在20世纪70年代，Hansen等([3]Rinkevich B.J Biotechnol,1999,70:133)从淡水蜗牛成功建立了胚胎细胞系BGE，这也是水生无脊椎动物中唯一细胞系。但是，几十年过去了，海洋软体动物至今还没有成功建立一个细胞系，其细胞培养遭遇长期的失败，大部分细胞培养的尝试，通常在体外只能培养比较短的时间，同时微生物污染一直威胁着原代细胞培养，也是最终培养失败的主要原因之一。

至今，海洋软体动物细胞培养主要集中在原代细胞培养条件的改进方面，特别是培养基的优化。相对较为成功的例子包括，Merwe等([4]Van der Merwe M，Auzoux-Bordenave S，Niesler C.Cytotechnology，2010，62(3):265－277.)报道成果原代培养了鲍外套膜血淋巴等组织细胞。Odintsova等([5]Odintsova NA，Dyachuk VA，NezlinLP.Cell and Tissue Research，2010，339(3):625-637)报道将Mytilus trossulus的幼体细胞原代培养了70多天。

目前，研究人员普遍认识到海洋软体动物细胞的营养需求和生长条件与脊椎动物差异显著。海洋软体动物原代细胞培养条件优化多集中改善原代细胞培养的营养因子与细胞生长因子。L15基础培养基是公认的相对比较适合软体动物细胞培养的基础培养基，胎牛血清也普遍被用于海洋软体动物的细胞培养，小牛血清或者待培养动物的组织提取液或血淋巴液也被报道能促进原代细胞的生长与分裂，他们的使用量大多控制在5-20％([6]ChenSN et al.Methods Cell Sci,1999,21:183)。