[发明专利]一种TaqMan‑MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种TaqMan-MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的引物及其应用。

背景技术

酒精代谢过程产生的乙醇和乙醛的过量富集及硝酸甘油代谢的受阻经常会给人带来健康隐患，如酒精性肝病，神经疾病，心血管疾病，食管癌，胃癌等疾病。人类乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)是酒精代谢的关键酶。ALDH有19种同工酶，其中ALDH2最为重要，具有脱氢酶活性，对人体内乙醛的氧化发挥主要的作用(即与体内代谢酒精的能力直接相关)。ALDH2主要作用为乙醇代谢通路中的第二相代谢的催化剂，在线粒体内将乙醛转化为乙酸释放入血液，而后血液将乙酸输送到其他组织进入三羧酸循环，最后氧化为CO₂。分子生物学研究显示，ALDH2是一个四聚体，只要其中的一个亚基缺少或发生结构改变就足以导致其酶活性的丧失或活性下降。

迄今为止，研究者在人类ALDH2基因的序列上发现了84个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点，但研究主要集中在rs671位点上，即ALDH2基因第12外显子中的一个SNP，导致赖氨酸替代了原有的谷氨酸(Glu504Lys)。Glu504Lys是ALDH2基因上最重要的一个SNP位点，该位点与ALDH2蛋白的空间结构有关，因此影响该酶的活性。在人群中，ALDH2酶的基因以3种形式出现，具有正常催化乙醛活性的野生纯合型G/G，即ALDH2*1*1；催化活性下降的突变杂合子型G/A(只有ALDH2蛋白正常水平的6.25％)，即ALDH2*1*2；失去催化活性的突变纯合子型A/A，即ALDH2*2*2。ALDH2基因的变异对乙醛的催化活性的影响是影响饮酒人群肿瘤发生的重要因素，其中以其rs671位点的多态性最为显著。

最新的研究成果表明，ALDH2除了具有脱氢酶活性以外还具有酯酶活性，可以催化硝酸甘油水解产生NO.，ALDH2基因的Glu504Lys多态则会影响硝酸甘油的疗效。有文献表明这种突变与部分国人含服硝酸甘油治疗心绞痛无效相关。因此,临床医师在使用硝酸甘油时,需考虑患者的这一遗传因素。

通过对ALDH2基因的检测，将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据。ALDH2基因检测的临床意义包括：(1)揭示个体酒精代谢能力的不同。ALDH2基因与酒精在人体内的分解代谢有关。ALDH2基因突变将使酒精在体内的代谢过程受阻，导致大量乙醛滞留在体内。除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌；(2)检测ALDH2酶对药物代谢速率的快、慢，合理调整药物剂量，提高疗效、降低毒副反应发生概率；(3)指导临床正确使用硝酸甘油，减少用药无效情况。如果病人基因中携带有ALDH2(Glu504Lys)突变，乙醛脱氢酶2的硝酸脂酶活性会降低10倍以上，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。

在过去的20年，为适应临床需要，以DNA探针和聚合酶链反应(PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方法已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于临床工作。从最初的焦磷酸测序到后期的基因芯片等技术都可以检测基因多态性位点分型，但焦磷酸具有扩增时间较长、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术虽然可同时检测多个位点，但成本也非常高，操作复杂，所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。只有探针特异结合的片段发生PCR扩增时，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。针对TaqMan探针荧光猝灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针–MGB探针(miNO.r groove binder oligodeoxynucleotide conjugate)，3’段采用了非荧光性的猝灭基团–猝灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。该技术不仅实现了对核酸特异性扩增的实时监测，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。

发明内容