[发明专利]一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法

权利要求书

1.一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法，分离出的分泌1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶菌株(以下简称ACC菌株)，为单种或多种混合菌株，其特征在于包括ACC菌株的筛选方法、ACC菌株的评价方法以及对铜尾矿上生长植株促生效应的评价方法。

2.根据权利要求1所述的一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法，其特征在于所述菌株的筛选方法包括：

1)菌株的扩繁和初筛：选用PAF培养基对菌株进行扩繁，用DF培养基对菌株进行分离；将初分后的菌株，在DF培养基上进行二次分离，挑选菌株纯化后保存备用；

2)菌株ACC脱氨酶活性的测定：先利用TSB培养基富集培养，然后分离菌种，提取ACC脱氨酶，蛋白质测定采用BioRad蛋白质微量测定法进行测定；

3)菌株IAA分泌能力的测定：先在DF培养液中培养2天，8000g下离心提取上清液，在535nm处测吸光度(OD535)；

4)菌株分泌铁载体能力测定：在含有铬天青S以及氯化铁的LB固体培养基上培养，根据其显色圈的大小判断其分泌铁载体的能力；

5)菌株溶磷能力的测定：纯化菌株在Pikovskaya氏培养基上培养7天，观察溶磷圈大小，比较无机磷溶解能力大小。

3.根据权利要求2所述一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法，其特征在于：所述PAF培养基配方为(1L)：蛋白胨10g，酪蛋白水解物10g，MgSO4 1.5g，K2HPO4 1.5g，甘油10ml，pH值为7.5；所述TSB培养基(1L)：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.5g，K2HPO4 2.5g，pH值为7.5；所述DF培养基配方为：KH2PO4 4g，Na2HPO4·7H2O 11.3g，MgSO4 0.2g，FeSO4 0.01mg，葡萄糖2g，葡萄糖酸2g，柠檬酸2g，(NH4)2SO4 2g，pH值为7.5；所述ADF培养基配方为(1L)：50mmo l/LACC替代DF培养基中的(NH4)2SO4作为唯一氮源；所述Pikovskaya氏培养基为(1L)：酵母提取物0.5g，葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.2g，MgSO4 0.1g，MnSO4 0.0001g，FeSO4 0.0001g，pH值为7.5；所述Salkowski试剂配方为：浓硫酸150ml，蒸馏水250ml，0.5mol/L FeCl3·6H2O 7.5ml(1.35g溶于10ml水中)；所述LB培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH值为7.5。

4.根据权利要求1所述的一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法，其特征在于所述多种菌株评价方法包括ACC脱氨酶分泌量、IAA分泌量、铁载体分泌量以及溶磷能力。

5.根据权利要求1所述的一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法，其特征在于所述的多种促生菌对植株促生效应的评价方法包括：

1)菌株重金属耐性试验：在ADF培养基中加入不同量的硫酸铜，将培养皿按照硫酸铜浓度0mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L以及1000mg/L，设置成5个不同梯度；将纯化后的菌种分别接种于不同浓度的固体培养基上，测试其生长情况；

2)盆栽试验：分别选用本土及外来植株进行ACC接种试验，以未浸染的种子为对照，取铜尾矿表层0-30cm土壤，均匀过筛，灭菌后装于栽培盆中；将供试植物种子用70％酒精消毒1分钟，1％次氯酸钠消毒10分钟，之后用无菌水洗涤3-5次；将消过毒的植物种子，浸与菌悬液中2-4h，菌悬液为一种菌株或几种菌株混合，取出播种用，以无菌水的处理作为对照；将处理后的种子播种于尾矿土中，每盆10粒种子，追施有机肥，并在种子发下后2-4天和15-20天追施加菌剂，温室培养，隔天浇一次水，维持土壤的含水量。60-180天后收获盆中的植株，分别测量根长、根干重、地上部分长和地上部分干重，以及地上地下部分的重金属含量分析。