[发明专利]一种基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗

说明书

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗。

背景技术：

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)为上消化道疾病的主要致病菌，它的感染不但与胃炎、胃溃疡及非溃疡性消化不良有关，而且与黏膜相关性淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌也有重要关系。Hp在全球人群的慢性感染率达50％以上，我国人群的平均感染率高达58.07％，其严重危害着人类的健康安全。

Hp感染的治疗多采用质子泵抑制剂外加两种抗生素的“三联”疗法。尽管此方案能有效地清除已感染的Hp，但存在诱导耐药菌株流行、药物副作用、费用较高和病人依从性差等问题。因此，接种Hp疫苗是预防和控制Hp感染的有效措施。

但是，蛋白疫苗经口服接种，由于要通过胃酸屏障和消化道严苛的环境，免疫原性都很弱。故使用适宜胃肠道定植微生物作为口服疫苗载体，为研制Hp疫苗的有效途径。而目前Hp疫苗研制所采用的消化道疫苗递送系统(载体系统)，一般是消化道减毒细菌(如伤寒)或病毒，但它们仍然存在回复突变和安全性问题。主要存在以下的缺陷：①现Hp全菌疫苗主要成分为菌体超声破碎物和甲醛灭活的全菌体。使用甲醛灭活后的HpSS1全菌体与黏膜免疫佐剂霍乱毒素(CT)免疫小鼠，发现其能有效抑制Hp感染并控制再次感染。但是Hp全菌体粗制抗原成分复杂，存在副作用较大、免疫效果差、易通过交叉免疫反应导致自身免疫性疾病及肠道菌群失调、不易标准化等缺点，不适用于人体接种。同时，Hp为微需氧菌，在培养时对氧含量、营养、温度、湿度等条件要求非常严苛，且培养时间长，费用高，产量低，不适于大规模培养生产。因此，Hp全菌体疫苗的开发不具现实意义。②亚单位抗原具结构简单、安全性好、适于工业化生产等优点。但是蛋白疫苗经口服，难以通过胃肠道严苛环境，大部分蛋白降解，降低了免疫原性。

枯草芽孢作为口服型疫苗载体，具有很多常规疫苗载体不可比拟的优点：它的生物安全性高：其属革兰阳性菌，不产生毒素，而且还是常用的益生菌之一，已用为人的功能性食品、动物饲料添加剂等。①枯草芽孢杆菌能产生多种消化酶，其具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解复杂碳水化合物的酶，如果胶、葡聚糖、纤维素等酶，帮助对营养物质的消化吸收。②枯草芽孢杆菌能产生多种营养物质，其能够合成多种维生素如尼克酸、叶酸、烟酸、维生素B1、B2、B6、B12等，促进机体对蛋白质的消化、吸收。③枯草芽孢杆菌产生抗生素和细菌素，可通过拮抗作用抑制致病菌的生长，从而起到防治疾病的效果。④枯草芽孢有独特的免疫学特性：口服的芽孢在动物肠道能被胃肠道相关淋巴组织(MALT)识别，发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜上的相关淋巴组织，使分泌型(SIgA)抗体分泌增强，提高免疫识别能力，并诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫系统。

霍乱毒素Cholera toxin(CT)是由霍乱弧菌产生的外毒素，是霍乱弧菌的主要致病因子，具有A、B两个亚单位。其中A亚单位(CTA)具有ADP核糖基转移酶活性，是毒素的活性中心。5个B亚单位(CTB)装配成五聚体，以高亲和力结合表达于有核细胞细胞膜上的GMl神经节苷酯，为球形A亚单位结合细胞表面受体后内化所必需。CT虽能有效增强针对抗原的局部免疫和系统免疫，但是由于其毒性，限制了其应用。霍乱毒素B亚单位无毒性，具有很强的免疫原性，能刺激产生黏膜IgA和血清IgG抗体，具有能加强抗原表位的抗原性的特点，故本发明使用CTB作为疫苗佐剂。

发明内容：

本发明的目的是提供一种廉价、安全、高效的基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗及其构建方法。

本发明是使用益生菌枯草芽孢杆菌作为载体，CTB作为佐剂，将CTB与Hp UreB融合表达于枯草芽孢表面，使用重组枯草芽孢对幽门螺杆菌感染进行预防。具体是将粘膜佐剂霍乱毒素B(CTB)与Hp疫苗分子尿素酶B(UreB)融合表达于枯草芽孢表面，构建表面表达CTB-UreB芽孢疫苗。

本发明的基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗，其特征在于，其是将CotC-UreB或Cotc-CTB-UreB基因片段转入表达载体中，然后将含有CotC-UreB或Cotc-CTB-UreB的表达载体转化进入枯草芽孢杆菌中，从而得到基于枯草芽孢载体的幽门螺杆菌口服疫苗，所述的CotC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的CTB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的UreB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。