[发明专利]一种基于组织切片的三维模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种基于组织切片的三维模型的构建方法。

背景技术

免疫组织化学(Immunohistochemistry，以下均简称IHC)又称免疫细胞化学，是指带显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它将免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体和受体等)。

随着显微成像技术的进步，近十年陆续出现了如下三种三维(3D)组织形态学技术：1.组织块透明扫描技术(Dodt,et al.,Nat Methods 2007；Becker,et al.,CSH Protocols,2013)，2.双光子断层扫描技术(Ragen,et al.,Nat Methods 2012)，3.荧光微光学切片断层呈像技术(Li,Gong,Zhang,et al.,Science,2010；Gong,Xu,et al.,Neuroimage,2013)。常规的IHC技术虽能呈现组织抗原清晰的二维形态和分布，但无法展现抗原在组织中的三维形态和分布。现有组织3D技术也存在如下缺点：1.第一种组织块透明扫描技术存在以下缺陷：耗时长(约1-2月)、组织易变形、大组织块透明效果差；2.双光子断层扫描技术和荧光微光学切片断层呈像技术只能针对带有自发荧光标签的组织，不能通过抗体标记组织抗原；3.以上这些3D技术的实现均需要昂贵的实验设备。

有鉴于此，有必要提供一种利用常规实验仪器设备能进行的基于免疫组织化学切片的三维模型的构建方法。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种基于组织切片的三维模型的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的一个方面提供了一种基于组织切片的三维模型的构建方法，包括以下步骤：

对组织进行连续切片，分成若干份，对所有的组织切片进行染色标记后，将所有组织切片完整贴到对应的载玻片上；或者：所有的组织切片自带荧光信号无需标记，将所有组织切片完整贴到对应的载玻片上；然后对扫描的组织切片图片根据载玻片编号对组织切片按顺序命名，使所有图片能按切片原始顺序排列，进行校准，对校准好的图片进行3D合成，获得所述基于组织切片的三维模型。

所述组织为实心组织或空心组织，所述实心组织为如脑、肝、肾、甲状腺、胰腺、睾丸等中的至少一种，均可用冰冻切片的方法直接进行3D重构；所述空心组织为心、肺、食管、胃、肠、膀胱等中的至少一种，均可用石蜡切片的方法直接进行3D重构。

所述切片的厚度为4-30μm。

所述若干份为6～96份，优选24份。

所述染色标记为针对组织切片的各种染色标记(如免疫组织化学染色(IHC)、苏木素-伊红染色(HE)、尼氏染色、胶原纤维染色、网状纤维染色、FJ染色、tunnel染色、DAPI染色等)，及通过转基因或病毒注射等手段使组织细胞表达自发荧光蛋白而无需进行后续标记。

所述“对所有的组织切片进行染色标记后，将所有组织切片完整贴到对应的载玻片上”包括以下步骤：将所有的组织切片分别转入对应的细胞培养板的小孔中；常温下，切片用PBS洗三次，每次五分钟；用浓度为0.3％的H₂O₂孵育30分钟；用PBS洗三次，每次五分钟；用浓度为0.5％的Triton孵育30分钟；在浓度为3％的BSA中孵育30分钟；在一抗中孵育24小时，温度为4℃；用PBS洗三次，每次五分钟；在生物素化的二抗中孵育2小时；用PBS洗三次，每次五分钟；在AB液中孵育2小时；用PBS洗三次，每次五分钟；在DAB试剂盒中孵育5分钟；用PBS洗三次，每次五分钟；贴片后水化、复染、分化、脱水、透明、封片、保存；

或，将所有的组织切片分别转入对应的细胞培养板的小孔中；常温下，切片用PBS洗三次，每次五分钟；用浓度为0.5％的Triton孵育30分钟；在浓度为3％的BSA中孵育30分钟；在一抗中孵育24小时，温度为4℃；用PBS洗三次，每次五分钟；在荧光二抗中孵育2小时；用PBS洗三次，每次五分钟；贴片、封片、保存；