[发明专利]一种桔小实蝇抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种桔小实蝇抗菌肽及其制备方法，以及在生物医学、农学、食品学和化妆品技术领域的应用。

背景技术

自从青霉素等抗生素被发现以来，对病原菌感染性疾病的防治产生了革命性飞跃。与此同时，人们也意识到病原微生物将最终会对青霉素等抗生素产生抗性，但是令人惊讶的是抗性产生的速度之快和抗性的广泛性。随着抗菌药物的广泛应用和滥用，在不到50年的时间内，原来容易被杀死的细菌开始有了耐药菌株及多重耐药菌株。

为了应对耐药菌感染，人们在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出现的抗菌肽就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物替代对象。昆虫抗菌肽是昆虫细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽，大多数对细菌有较广谱的抗性，有的对真菌、病毒、原虫等也有抑制作用，尤其对耐药菌株有明显的杀伤作用，且不破坏真核生物体的细胞，无免疫原性。

桔小实蝇是蔬菜和水果上的重要害虫。每年该种昆虫造成的经济损失和防治费用都是相当惊人的，也是目前导致部分省份尤其是广东省的柑橘、枇杷等果树挂果时为害特别严重的害虫之一。桔小实蝇的成虫、幼虫及蛹生长在含有细菌的恶劣环境中，但其自身却不受这些病原菌影响，显示它具有较强的免疫能力。关于桔小实蝇抗菌活性物质的相关技术研究具有重大的意义，目前尚未见发表的相关技术报道。

本发明利用细菌针刺的方法，免疫诱导桔小实蝇蛹分泌抗菌活性物质，从桔小实蝇蛹分泌的抗菌活性物质中分离纯化得到桔小实蝇抗菌肽Bactrocerin，本抗菌肽氨基酸全序列经蛋白数据库搜索比较未发现有任何相似的多肽。

发明内容

本发明的一个目的是填补现有技术的不足，提供一种新的桔小实蝇抗菌肽(Bactrocerin)；本发明的另一个目的是提供所述桔小实蝇抗菌肽的制备方法；本发明还有一个目的是提供所述桔小实蝇抗菌肽的应用。

本发明提供一种桔小实蝇抗菌肽，是从桔小实蝇蛹分离纯化得到的一种多肽，分子量为2.3道尔顿，等电点为11.43；所述抗菌肽的全序列为NH2-VGKTWIKVIRGIGKSKIKWQ-COOH，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，即颉氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苏氨酸-色氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-颉氨酸-异亮氨酸-精氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丝氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-色氨酸-谷氨酰胺。

本发明同时提供了所述桔小实蝇抗菌肽的制备方法：

方法一，本发明利用细菌针刺的方法，免疫诱导桔小实蝇蛹分泌抗菌活性物质，从桔小实蝇蛹分泌的抗菌活性物质中分离纯化得到桔小实蝇抗菌肽Bactrocerin，本抗菌肽氨基酸全序列经蛋白数据库搜索比较未发现有任何相似的多肽。

方法一包括以下步骤：

(1)用混合菌液免疫诱导桔小实蝇蛹；

(2)桔小实蝇蛹组织匀浆，得到粗提物；

(3)粗提物经纯化后得到所述抗菌肽。

步骤(1)所述用混合菌液免疫诱导桔小实蝇蛹的方法为采用1号昆虫针蘸取生理盐水重悬的混合菌液针刺桔小实蝇蛹的中部；所述生理盐水为含150mM NaCl和5mM KCl；所述混合菌液是OD600为0.3的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α)混合液。步骤(2)所述粗提方法是称取一定量的经混合菌液诱导后的桔小实蝇蛹，按重量体积比为1∶4～1∶6的比例加入相应体积的提取缓冲液，冰浴上充分研磨，离心去除血细胞和其它组织沉淀，取上清。

所述提取缓冲液为50mmol/L醋酸铵中加入终浓度为1.5μmol/L的蛋白酶抑制剂Aprotinin和终浓度为20μmol/L苯基硫脲；所述离心条件是在温度为4℃、10,000×g下离心30至35分钟。

步骤(3)所述纯化方法为经离子交换柱层析、反相快速蛋白液相色谱和反相高压液相色谱纯化。

所述离子交换柱层析的方法是将桔小实蝇蛹组织匀浆的粗提物上样于50mmol/L醋酸铵pH 5.0缓冲液平衡的CM Sepharose FastFlow弱阳离子交换柱，交换柱长260mm，直径16mm，用50mmol/L～1mol/L线性梯度的醋酸铵pH 5.0缓冲液洗脱，收集第III峰；