[发明专利]一种检测玉米赤霉烯酮免疫亲和凝胶检测柱及其制备方法

说明书

本发明提供了一种可视化快速检测食品中生物毒素玉米赤霉烯酮的免疫亲和凝胶检测柱的制备方法。以琼脂糖凝胶为固相载体，将玉米赤霉烯酮抗体和溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备抗体胶作为检测层，将HRP抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备HRP抗体胶作为质控层，装入1mL的固相萃取柱，制备免疫亲和凝胶检测柱。本发明研制了一种新型快速定性半定量检测食品中生物毒素玉米赤霉烯酮的免疫亲和凝胶柱检测产品，检测限为5μg/L。发明具有以下突出的优点：1、特异性高，灵敏度好；2、样品前处理简单；3、检测耗时短，准确性高；4、操作简便，不需要大型仪器的辅助。

技术领域

本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学、酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种玉米赤霉烯酮免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。

背景技术

玉米赤霉烯酮主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、串珠镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌也能产生这种毒素。1980年，李季伦教授首次证实了玉米赤霉烯酮存在于植物体内，这一现象吸引了科研人员重视。几十年来，研究人员已经在玉米、小麦、燕麦和大麦等农作物中发现了玉米赤霉烯酮污染的踪迹。目前，食品中玉米赤霉烯酮的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析(TLC)法、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、高效毛细管电泳法(HPCE)、免疫分析法(IA)等。其中高效液相色谱法是广泛应用的确证方法，方法准确性高，但是前处理方法繁琐，需要昂贵的仪器以及专业的操作人员，检测费用昂贵，不适合进行现场快速检测。因此，研制一种灵敏度高、操作简便的真菌毒素快速检测手段势在必行。免疫检测方法，可有效避免样品处理，仪器等因素的制约，而且方法的特异性强，灵敏度高，甚至可以制成试纸用于现场快速检测。然而试纸条检测也易受样品基质的影响，在不同食品样品检测中受到一定限制。本发明阐述的凝胶柱免疫检测产品为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的玉米赤霉烯酮的检测分析提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单的检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。

发明内容

本发明提出一种可以定性半定量的检测食品中的玉米赤霉烯酮的简单、省时、灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱的制备。只要样品中含有酶标记抗原，凝胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定性或半定量检测食品样品中的玉米赤霉烯酮的目的。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

封闭胶的制备

(1)溶胀：称取1.00g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到80mL的配制好的HCl溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为3.5mL)。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到具砂板层析柱中，再加入200mL HCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。

(3)封闭：加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。

(4)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。

(5)贮存：待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mL PBS(含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。

玉米赤霉烯酮抗体胶和HRP抗体胶的制备

(1)溶胀：准确称取0.50g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好的HCL溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为1.8mL)。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL HCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。