[发明专利]一种猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗

说明书

本发明涉及一种猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗的制备与应用。所述疫苗以猪肺炎支原体膜蛋白：粘附蛋白P97，脂蛋白P65、特异性膜蛋白P46 B细胞表位、Th表位、CTL表位以及霍乱毒素B亚基作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接，克隆入pRSETA载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、制剂等工艺，获得具有理想免疫原性的猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗。制剂过程使用了自制的黏膜佐剂，使疫苗的生产和使用过程更加简易、方便。动物实验表明，猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗不仅安全性良好，而且能够激发有效的粘膜免疫、体液免疫与细胞免疫反应。

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将霍乱毒素与猪支原体肺炎有关的黏附蛋白P97、脂蛋白P65以及特异性膜蛋白P46抗原表位串联并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、制剂等工艺，得到一种猪支原体肺炎重组多表位黏膜疫苗以及该疫苗在预防猪支原体肺炎中的应用。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal hyopneumoniae，MHP)广泛流行于世界各养猪国家，猪场一旦感染就很难净化清除。该病主要临床表现发热、咳嗽、呼吸困难，食欲减退、生长阻滞，饲料转化率降低，上市时间延迟。因此，尽管猪感染猪肺炎支原体后的死亡率不高，但仍旧严重影响养猪企业的经济效益。猪肺炎支原体还会造成感染猪的肺部损伤，导致免疫抑制和继发感染，导致该病与猪流感、蓝耳病、伪狂犬病和猪2型圆环病毒病等病毒性疾病和巴氏杆菌病、胸膜肺炎、链球菌病和副猪嗜血杆菌病等细菌性疾病，形成猪呼吸系统疾病综合征，增加了猪病诊断和预防控制的难度。

我国对该病的血清流行病调查显示，95％的猪场MHP血清抗体呈现阳性，断奶仔猪血清抗体阳性率高达30％，种猪和育肥猪血清抗体阳性率高达100％，血清阳性率随着日龄的增长不断升高。目前，对MHP的保护性抗原和免疫机制方面的研究均没有突破性进展，导致临床上缺乏有效的疫苗保护和治疗方法。

肺炎支原体要在呼吸道上皮细胞定植、增殖并造成肺部损伤，必须克服粘液纤毛系统的清除作用，穿过糖基化粘蛋白层，克服宿主胞外成分对MHP定植的阻断逃避宿主适应性免疫应答，牢固地粘附在呼吸器官的纤毛上，细胞膜成为了其致病性的关键。研究发现支原体可以招募肝磷脂到胞膜表面，肝脂与细胞外基质结合后，可以增加MHP定植到宿主呼吸道上皮细胞纤毛的能力。MHP与猪呼吸道纤毛的黏附是多个黏附因子共同作用的结果，黏附机制还没得到完全证实，但已鉴定出多个黏附因子。目前，己经得到的黏附蛋白主要有：P97、P102、P107、P116、P146、P116、P159、P216、P271。在猪肺炎支原体中黏附蛋白的表达是有差异的，支原体可能通过粘附因子的这种差异表达来逃避宿主免疫系统的识别。

猪肺炎支原体隶属软膜体纲，支原体属，是一种能够自我复制、进化速率快的最小的原核生物。MHP结构简单，整个细胞由DNA、核糖体和细胞膜3种细胞器组成，这是进行自体繁殖和合成大分子所必需的最低限度的细胞器种类。缺少细胞壁，所以没有固定的形态，大小不一，在挤压下能够通过0.22μm的滤器。支原体能够合成自身大分子，但由于其基因组小，携带信息量不多，而且G+C％多低于30％，生物合成能力有限，必须从外界摄取一些比较复杂的基质或前体。支原体基因密码子的表达有时不同于一般细菌的密码子含义，猪肺炎支原体用TGA编码色氨酸，而一般细菌以TGG编码色氨酸，TGA作为终止密码子。