[发明专利]一种犬血浆中右旋雷贝及其代谢产物的浓度检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及一种犬血浆中右旋雷贝及其代谢产物的浓度检测方法，具体地说，涉及一种LC-MS/MS法测定犬血浆中右旋雷贝及其代谢产物的浓度。

背景技术

雷贝拉唑钠是苯并咪唑衍生物，可通过抑制胃壁细胞H⁺、K⁺-ATP酶降低胃酸分泌，治疗胃肠溃疡和返流征等，属于PPIs类(质子泵抑制剂)的胃肠用药。雷贝拉唑钠化学结构上含有手性基团，该药为消旋物(R:S＝1:1)，目前临床上市应用的PPIs类药物(奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑等)多为消旋物，而单一的光学异构体S-奥美拉唑和S-泮托拉唑也已上市销售，表明雷贝拉唑拆分后以单一对映体成药有很好的可行性。

据文献报道，组胺和阿司匹林所致的大鼠胃溃疡模型研究中，右旋雷贝拉唑药效显著优于雷贝拉唑消旋物和左旋雷贝拉唑；治疗GERD(胃食管反流病)的临床试验中，右旋雷贝拉唑也显示出更好的药效，优于左旋雷贝拉唑。以上文献表明，与雷贝拉唑消旋物相比，右旋雷贝拉唑具有专一性、疗效更优的优势，值得进一步开发。

目前文献中仅有雷贝拉唑的测定方法，此方法不足以满足对右旋雷贝拉唑及其代谢产物的药代和毒代研究，测定血浆中右旋雷贝拉唑及其代谢产物的浓度检测方法未见文献报。

本发明采用LC-MS/MS法，即液相色谱-串联质谱法测试测定犬血浆中右旋雷贝拉唑及其代谢产物浓度，蛋白沉淀法处理样本，具有线性范围广、灵敏度高、操作简便、准确快速等特点，用于药代动力学及毒代动力学研究中右旋雷贝拉唑及其代谢产物在犬血浆中浓度的测定。此方法符合化学药物临床前药代动力学研究技术指导原则和生物样品分析国际规范的有关要求。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种线性范围广、灵敏、快速测定犬血浆中右旋雷贝拉唑及其代谢产物血药浓度的方法。此方法可用于药代动力学和毒代动力学的研究，为其临床给药提供有益的参考。

一种血浆中右旋雷贝拉唑及其代谢产物的浓度检测方法，包括步骤(1)样品制备，(2)采用液相-质谱联用检测，(3)标准曲线制备，(4)犬血浆中右旋雷贝拉唑及其代谢产物测定。

所述步骤(1)样品制备的步骤包括：取待测血浆样本25μL，加内标工作溶液25μL，加200μL乙酸乙酯，斡旋混合，离心5min(12000r/min，4℃)，取有机相180μL，氮气吹干，残留物加入50μL10mmol/L乙酸铵溶液-乙腈(1:1)复溶，斡旋，离心5min(12000r/min，4℃)，取上清进样分析。

所述内标工作溶液中内标为地西泮。

所述步骤(2)采用液相-质谱联用检测的步骤包括：

(a)液相色谱条件色谱柱：手性色谱柱；流动相：10mmol/L乙酸铵(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：初始为10％B；0～1.5min，5％B；1.5～4min，5％B；4～13min，18％B；13.01～14min，10％B。

(b)质谱条件：质谱采用Agilent 6460三重四极杆串联质谱仪，离子化方式：电喷雾-正离子(API-ES)；多反应监测分析模式(MRM)。

所述(a)液相色谱条件中，色谱柱为CHIRAL-AGP手性色谱柱(150mm×4mm，5μm)，流速1.0mL/min，柱后采用1:3三通分流；进样量为15μL。

所述(b)质谱条件中，干燥气：N₂；干燥气流速11L/min，干燥气压力45psi，干燥气温度为350℃，毛细管电压4000V。监测方式：MRM，监测条件见表1。

表1质谱监测条件

所述(3)标准曲线制备的步骤包括：分别取右旋雷贝拉唑及其代谢产物系列工作液20μL，加入犬空白血浆(抗凝剂为肝素钠)180μL斡旋混匀，配成系列血浆标准样品，浓度见表2。按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清按步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，以分析物的浓度为横坐标，分析物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法(权重为1/x²)进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。

表2血浆标准样品浓度