[发明专利]一种生产复苏促进因子的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种生产复苏促进因子(Resuscitation Promoting Factor,RPF)的基因工程菌和利用该基因工程菌快速制备高纯度RPF蛋白的方法，具体涉及重组蛋白的应用。

背景技术

复苏促进因子(Resuscitation Promoting Factor,RPF)是由俄罗斯Mukamolova课题组发现的一种由Micrococcus luteus在对数生长期后期分泌，在皮摩尔(10^-12mol/L)浓度下就能使处于活的但非可培养(VibleBut non-Culturable,VBNC)状态的自身菌体重新恢复其生长繁殖能力的蛋白质。RPF除了对自身VBNC菌体有复苏促进作用外，还可以复苏与其近缘的处于VBNC时期的革兰氏阳性菌Mycobacterium属的部分菌种，与该rpf相似的基因也在链霉菌、棒状杆菌等高GC的革兰氏阳性菌中存在。Mukamolova等人还报道了RPF采用自分泌或旁分泌的方式分泌信号，不但能使休眠中的VBNC微生物复活，还可以刺激某些细菌的生长，并能调控细胞的繁殖过程。

目前有关RPF的研究主要集中在对人体VBNC菌体(如结核分枝杆菌属)的复苏、免疫学及结核病的快速诊断等方面，然而利用RPF对于土壤、水体等环境样品中处于VBNC状态的特殊微生物资源发掘国内外还鲜有报道。

发明内容

本发明提供一种利用生物工程技术构建生产重组复苏促进因子的基因工程菌，应用于土壤、水体等环境样品中处于VBNC状态的的微生物的复苏和分离。

一种生产复苏促进因子的基因工程菌，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，菌株号为pET28a-RPF(WT)，保藏编号为CGMCC No.13217。

藤黄微球菌(Micrococcus luteus)含有有编码复苏促进因子基因(Genbank登录号CP001628)。本发明将Micrococcus luteus复苏促进因子基因装载在pET-28a(+)载体上，转入到大肠杆菌宿主中，得到一株工程菌。该工程菌已于2016年10月31号保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13217。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli，菌株号为pET28a-RPF(WT)。

所述编码复苏促进因子基因rpf的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种如所述基因工程菌在制备高纯度重组RPF蛋白中的应用。利用上述工程菌简单、快速制备高纯度的重组RPF蛋白。

重组RPF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种所述基因工程菌在复苏和分离环境样品中活的但非可培养状态微生物中的应用。包括如下步骤：将所述基因工程菌表达的重组RPF蛋白分离纯化后加入环境样品培养体系中，培养结束后收集微生物。

进一步地，所述环境样品为土壤样品，更进一步地，所述土壤为垃圾填埋场渗滤液均质池周围土壤样品。

优选地，所述重组RPF蛋白的添加终浓度为4～6μg/mL；进一步地，终浓度为5μg/mL。

基因工程菌表达重组蛋白的步骤为：将所述基因工程菌在含卡那霉素的LB培养基中培养过夜；次日接种至相同抗性的新鲜培养基中，待菌体生长到OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入异丙基硫代β-D-半乳糖苷，降低培养温度至20～22℃，低转速培养12-16小时后离心收集菌体，从菌体中分离纯化重组RPF蛋白。

本发明是利用工程菌制备的RPF蛋白促进土壤样品中潜在休眠细菌生长，提高分离丰度，可应用于环境样品(土壤、水体等)中特殊生理功能微生物类群的发掘和分离。自然界中广泛存在着活的但不可培养微生物，这些微生物资源通过传统的微生物分离方法无法获得，通过添加本发明所涉及重组RPF蛋白，可促发这类微生物生长，应用于某些环境样品中微生物资源多样性的发掘。

本发明的工程菌菌株的制备方法及应用过程如下：

(1)以藤黄微球菌的基因组DNA为模板，通过PCR扩增rpf基因；将PCR产物插入到表达质粒pET-28a(+)多克隆位点处，构建重组质粒pET28a-RPF，随后将重组质粒转入大肠杆菌获得基因工程菌。