[发明专利]细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针，其特征在于：为香豆素四唑化合物W2，其结构式如式II所示：

其中，R为甲基。

2.权利要求1所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将香豆素衍生物加入乙醇水溶液中，接着加入浓盐酸，然后在5℃条件下加入NaNO₂水溶液，再在-15℃的条件下滴加到4-甲基((2-(苯磺酰)亚肼基)甲基)苯甲酸盐的吡啶中，恢复室温进行反应，萃取、减压蒸馏、得到W1；

(2)将步骤(1)中得到的W1和氢氧化锂在四氢呋喃、甲醇和水的混溶液中加热搅拌反应，反应终止后再调节溶液的pH值至出现紫色沉淀，得到中间体A；

(3)将步骤(2)中得到的中间体A、NHS和EDC在DMF中搅拌反应，反应终止后再加入饱和食盐水析出沉淀，得到四唑化合物B；

(4)将步骤(3)中得到的四唑化合物B加入到含有三乙胺的DCM和DMSO溶液中，然后加入牛磺酸水溶液搅拌反应，减压蒸馏，加甲醇稀释沉淀过滤后，调pH值至中性，再加入乙醚、过滤、取沉淀，得到W2，即为细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针；

步骤(1)中所述的香豆素衍生物的结构式如下所示：

3.根据权利要求2所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的香豆素衍生物和4-甲基((2-(苯磺酰)亚肼基)甲基)苯甲酸盐按摩尔比为10:9配比计算；

步骤(2)中所述的香豆素四唑化合物和氢氧化锂按摩尔比为1:20配比计算；

步骤(3)中所述的中间体A、NHS和EDC按摩尔比为1:2:2配比计算；

步骤(4)所述的四唑化合物B、三乙胺和牛磺酸按摩尔比为1:2：2配比计算。

4.根据权利要求2所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的乙醇水溶液为乙醇和水按体积比1:1配比得到；

步骤(1)中所述的乙醇水溶液的用量为按乙醇水溶液和浓盐酸的体积比6:1配比计算；

步骤(2)中所述的四氢呋喃的用量为按四氢呋喃、甲醇和水体积比2:1:1配比计算；

步骤(4)中所述的DCM的用量为按DCM和DMSO体积比4～6:1配比计算。

5.根据权利要求2所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的萃取为采用DCM进行萃取；

步骤(3)中所述的反应的时间为12h；

步骤(4)中所述的调pH值为用氢氧化钠的甲醇溶液进行调pH值；

步骤(4)中所述的反应为在氮气保护下进行反应。

6.权利要求1所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针在核酸标记领域中的应用。

7.根据权利要求6所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针在核酸标记领域中的应用，其特征在于通过如下方法实现：

(I)将细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针与具有氨基的核酸序列在硼酸钠缓冲液中避光孵育进行缩合反应，用预冷的无水乙醇将核酸沉降出来，得到香豆素四唑修饰的核酸；

(II)将步骤(I)得到的香豆素四唑修饰的核酸分别与异丙基丙烯酰胺和N-(2-羟乙基)马来酰亚胺在磷酸盐缓冲液中、紫外光照射下发生光点击反应，得到具有荧光响应的核酸。

8.根据权利要求6所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针在核酸标记领域中的应用，其特征在于通过如下方法实现：

①将细胞传代到培养皿中培养贴壁后，加入5-乙烯基-2’-脱氧尿苷进行培养；

②换成新的DMEM培养液孵育后，再加入细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针继续培养；

③加入新的DMEM培养液孵育后，再用紫外光照射进行反应。

9.根据权利要求8所述的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针在核酸标记领域中的应用，其特征在于：

步骤①中所述的细胞为肿瘤细胞；

步骤①中所述的加入5-乙烯基-2’-脱氧尿苷为加入终浓度为30～50μM的5-乙烯基-2’-脱氧尿苷；

步骤①中所述的培养的时间为12～20小时；

步骤②中所述的加入细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针为加入终浓度为10～20μM的细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针；

步骤②中所述的孵育的时间为3～6小时；

步骤②中所述的继续培养的时间为3～6小时；

步骤③中所述的孵育的时间为2小时；

步骤③中所述的紫外光波长为350nm；

步骤③中所述的紫外光的照射时间为8～14分钟。