[发明专利]AKAP4蛋白617位发生质量偏移的谷氨酰胺在制备重度少弱精诊断试剂中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及医学和分子诊断技术领域，具体涉及一种AKAP4蛋白617位发生质量偏移的谷氨酰胺作为生物标志物在制备重度少弱精诊断试剂中的用途。

背景技术

不孕不育已成为全世界范围内的生殖健康问题，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年来呈上升的趋势。造成男性不育的主要原因是少精弱精症。根据世界卫生组织标准规定，如果a级精子数<25％，(a+b)级精子数<50％，且精子活率低于60％的话，就可诊断为弱精子症。少精子症是指精液中的精子数目低于正常具有生育能力男性的一种病症，当男性的精子在每毫升低于2千万时，就为少精子症。

目前关于精子蛋白质组的研究有很多。Saraswat等利用UPLC-MS的方法在人类精子中定量了667个蛋白，并且分析出了20个健康人和弱精症患者精子中的差异蛋白(Saraswat M,Joenvaara S,Jain T et al.Human Spermatozoa Quantitative Proteomic Signature Classifies Normo-and Asthenozoospermia.Molecular&cellular proteomics:MCP,16(1),57-72(2017).)。最新更新的人类精子蛋白质组共6198个蛋白(Amaral A,Castillo J,Ramalho-Santos J,Oliva R.The combined human sperm proteome:cellular pathways and implications for basic and clinical science.Human reproduction update,20(1),40-62(2014).)。Gaigai Wang等利用高分辨质谱在人类精子中鉴定出4675个蛋白(Wang G,Guo Y,Zhou T et al.In-depth proteomic analysis of the human sperm reveals complex protein compositions.Journal of proteomics,79,114-122(2013).)。络氨酸磷酸化对于精子的运动、获能、超激运动等过程重要作用。Chying-Chyuan Chan等通过对20组正常人和弱精症患者的精子进行蛋白质组学分析发现有12种包括TUBGCP2在内的蛋白发生了过磷酸化(Chan CC,Shui HA,Wu CH et al.Motility and Protein Phosphorylation in Healthy and Asthenozoospermic Sperm.Journal of proteome research,8(11),5382-5386(2009))。

非编码氨基酸包括翻译后修饰和氨基酸突变，是调控蛋白功能和结构的重要方式，因此将疾病状态下异常的或者数量变化极大的非编码氨基酸作为疾病的生物标志物，进而用于诊断疾病的进程具有重要意义。但目前还未有关于非编码氨基酸作为与重度少弱精子疾病相关的生物标志物的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的提供一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选与应用。本发明首先利用NanoHPLC-MS/MS质谱系统和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白非编码氨基酸进行了深度的质谱分析；然后利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常和病人精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，从而将其作为重度少弱精症的分子标志物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：

(1)提取精子细胞全蛋白；

(2)将精子细胞全蛋白采用凝胶电泳分离，切胶酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品；

(3)将步骤(2)的样品采用纳流液相色谱分离，经纳流液相色谱分离后的样品再进行质谱检测，采集质谱数据；