[发明专利]间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法

说明书

本发明公开了一种间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法，该方法通过以米作为保藏基质，采用间歇生长法对红曲霉进行长期保藏。基质取水浸泡10‑60min，沥干流动水后分装入试管中，塞上棉塞，湿热灭菌。然后接入新鲜孢子悬液，搅拌均匀，培养4～7天，肉眼能观察到基质有红曲霉菌落生长，置冰箱4～8℃冷藏。每3年一次，从冰箱取出保藏物，置湿度95%RH，温度30℃的环境放置5小时，促使孢子萌发，移回冰箱冷藏。改良后的保藏法无需特殊设备和技术，操作简单、成本低廉、保藏期长。既能减轻人工劳力，也避免了传代时感染外界杂菌的可能，普通实验室都能实现。

技术领域

本发明涉及微生物菌种保藏方法，特别是红曲霉菌种的长期保藏方法。

背景技术

据估计全世界存在150万种真菌，但还不到5％的真菌被分离纯化，适合分离纯种保藏的方法更少，不同的菌，有不同的生理特性，需不同的保藏方法，没有一种保藏工艺能够适合所有菌类的保藏。不当的保藏方法常常导致生产菌种优良性能退化甚至菌种死亡，带来巨大损失。红曲霉为子囊菌纲曲霉科红曲霉属的真菌，其代谢产物用途广泛，不仅用于食品、染色、调味、制醋，还有药用价值。大多数成员都能兼性嗜高渗透压，能在较低水活度下生长。能利用淀粉、糊精等多种有机碳源[李钟庆等.综观红曲与红曲菌，中国轻工业出版社,2009,6:40]。目前此类产孢真菌的常用保藏方法有继代培养保存法[李世贵, 顾金刚.斜面法与橡皮塞法保藏丝状真菌的效果.微生物学通报,2002,29(4):118-120]、自然基质法[范立宝.食用菌菌种的简易保藏法.贮藏加工,2004,175(9):31]、冷冻干燥法[Heseltine, C.W., Bradley, B.J,et.al.Further investigations on thepreservation of molds. Mycology,1960, 52(5): 762-774]，这些保藏方法的优缺点见表一。

基质法和继代培养法保藏菌种时，通常要选用营养较为瘠薄的培养基。保藏培养基碳氮比较发酵培养基低，培养温度也比发酵生长时低些。因为保藏菌种时如果培养基营养成分丰富，碳氮比高，生长温度高，菌种的生长速度就会过快，次级代谢物分泌过多，菌体易衰老。

传统基质保藏法保藏的是最初长成的孢子。基本原理是将保藏基质的水分蒸发掉，使菌种处于生长停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。通常的操作方法是在培养时让自然基质上长出尽可能多的孢子，再经干燥，使保藏物水分降到8%以下后，再放到冰箱冷藏，进入干燥低温保藏阶段。此时的基质仅仅是孢子的载体，因此保藏阶段的基质不允许受潮，一旦受潮，孢子就会萌发生长，由于初期基质营养早已耗尽，萌发后长出的菌丝没有营养的供给加速了菌株的死亡。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提出一种间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法， 是利用红曲霉能在较低温度和水活度下生长的特性对普通基质保藏法的改良。

一种间歇生长法长期保藏红曲霉菌种的方法，步骤如下：

1）基质培养基的制备：选用米粒或者小麦粒，水浸泡10～60min，沥干流动水后分装入试管，塞上棉塞，湿热灭菌；

2）接种培养：接入新鲜红曲霉孢子液，搅拌均匀，30℃培养4～7天，至肉眼能观察到基质有红曲霉菌落生长；

3）冷藏干燥：将培养好的菌种置于冰箱内冷藏，水分升华得到干燥的基质培养基；

4）萌发：每3年一次，选择或者设置萌发环境，湿度为95%RH，温度为30℃，从冰箱取出菌种，在萌发环境放置5～8小时后，再移回冰箱4～8℃冷藏。

优选的基质培养基为黑米。

所述的萌发环境为梅雨天。

所述的水的温度20～40℃。

本发明的有益效果：