[发明专利]一种重组博落回防御素功能蛋白及其制备方法与应用

说明书

一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体；将上述得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白。本发明采用重组菌（含有核苷酸为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白编码基因片段的重组菌）表达得到的发酵产物抗菌活性高，将所生产的发酵液上清，直接用于体外抗菌实验，具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的能力，可用于制备抗菌饲料添加剂，工艺步骤简单，成本低廉，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种植物防御素的重组表达方法，尤其是涉及一种重组博落回防御素功能蛋白，以及利用酿酒酵母表达重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，以及博落回防御素的应用研究。

背景技术

防御素是一种遍布于动植物中的阳离子抗菌肽，是生物体长期进化的自身防御体系的重要组成部分，其大小约为5kDa，含有6个或者8个保守半胱氨酸残基，能直接作用于病原菌，是生物先天免疫系统中的重要物质。根据分子结构和来源的不同，可分为五类：哺乳动物α-防御素，β-防御素，θ-防御素，昆虫防御素和植物防御素。

植物防御素是一类阳离子肽，是植物内免疫系统的主要成分之一，参与了多种植物生理生化活动。植物防御素含8个保守半胱氨酸，形成4对链内二硫键来稳定其3条反向平行的β折叠片和1个α螺旋，构成所谓的Csαβ模体结构。植物防御素具有抑制真菌和细菌生长、抑制酶的活性、抑制癌细胞增殖和作为离子通道阻断剂等功能。

博落回属于罂粟科草本植物，是我国传统中草药，具有抑菌杀虫的功效。由于罂粟科植物大多富含生物碱而备受关注。目前关于罂粟科植物的研究也主要集中在其生物碱，博落回的研究亦是如此。

朱鹏程于2013年发表的“博落回叶片cDNA文库的构建及EST分析” ([D]. 湖南农业大学, 2013.)，公开了构建博落回叶片cDNA文库的构建以及初步的EST分析，但未报道博落回防御素的相关基因；李赛于2014年发表的《博落回叶cDNA文库表达序列标签分析和防御素重组表达》（[D]. 湖南农业大学, 2014.），公开了对博落回防御素基因的分析以及对预测的五种防御素前体中的McDef1和McDef5的基因序列，并采用大肠杆菌原核重组表达和毕赤酵母真核重组表达，其中包含的目的蛋白片段是前体蛋白去掉信号肽，包括中间肽和成熟肽；对表达产物进行蛋白质电泳，毕赤酵母表达产物未见相应的目的蛋白，仅采用pET32表达的产物有明显的含目的基因产物的蛋白，是融合蛋白，还需进一步采用蛋白酶酶切才能产生目的蛋白分子；大肠杆菌表达和毕赤酵母表达均未表达得到有活性的重组博落回防御素功能蛋白。以上重组表达方法中，由于博落回防御素的中间肽和成熟肽之间的剪切位点尚未明确，将两者一起同时表达时，中间肽的存在可能对表达产物的活性产生了负面影响。

因此，鉴于博落回防御素的优良性能和广泛的应用市场，亟需准确确定中间肽和成熟肽的分割位点，并在此基础上提供一种高效的博落回防御素功能蛋白的重组表达方法，并进一步对博落回防御素重组菌发酵工艺的优化以及发酵产物的应用研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种博落回防御素功能蛋白，以及高效表达博落回防御素功能蛋白、操作简单、易于产业化的重组博落回防御素功能蛋白的制备方法；确定采用重组菌大量表达博落回防御素的发酵工艺，以及发酵产物的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体；

2）将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；

3）重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白。