[发明专利]用于检测结核感染T细胞的抗原、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测结核感染T细胞的抗原，该抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29所示，任取SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.29中的八条多肽协同ESAT‑6和CFP‑10多肽及衍生物共同作用，特异性刺激结核分枝杆菌感染的T细胞能特异性的分泌IFN‑γ，增加检测的灵敏度。本发明提供了一种新的可用于结核感染T细胞的检测试剂盒，使用该试剂盒，直接对外周血进行抗原刺激，无需分离外周血单个核细胞，检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简便，检测成本较低，具有较高的临床应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及用于检测结核感染T细胞的抗原、试剂盒及应用。

背景技术

结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。据世界卫生组织，全世界有17-20亿的结核分枝杆菌感染者，每年至少200万人死于本病(谢建平，结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学，微生物通报.2001.28(5):92-97)。因此，准确筛检感染者的方法在结核病的防治甚至最终的消灭中扮演极其重要的作用。

现有的诊断技术对结核分枝杆菌感染者的诊断非常难。近几十年来，临床上采用结核菌素试验(TST)来诊断结核分枝杆菌感染者。但TST活性成份是纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tubercμLin，PPD)，是结核分枝杆菌培养上清液的粗提物，含有200多种成分，与卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)接种和环境分枝杆菌感染存在交叉反应。TST检测结果可被现在临床广泛使用的疫苗—卡介苗免疫所干扰[P.Andersen，et al.Lancet356(2000)1099-1104.]。从1921年及明卡介苗到现在为止，全世界已有35亿人接种卡介苗。因此TST对感染者的诊断价值受到很大的影响，导致TST诊断的准确性较低，因此我们无法根据其结果判断是否真正存在结核分枝杆菌感染。

对结核病病人的诊断技术中，痰涂片抗酸染色或痰菌培养，培养困难，耗时较长；肺部x射线检查肺部病理改变，也仅在具有典型的临床症状后才能诊断；其他血清学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率较高。有关研究人员指出，不同诊断性检查方法的敏感性和特异性如下：分枝杆菌培养(分别为73％和100％)；PCR(分别为42％和100％)；胸部X线(分别为67％～77％和66％～76％)；结核菌素试验(分别为94％和20％)；血清学(分别为33％和87％)。由此可见，现有的分枝杆菌检测方法的敏感性和特异性无法同时达到最优。

结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，分泌产生γ干扰素(IFN-γ)，后者发挥抗结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核分枝杆菌相遇后，会再次分泌产生IFN-γ，发挥抗结核感染作用。抗原特异的IFN-γ产生量与机体是否感染或发病密切相关。因此，如果采用结核分枝杆菌特异的抗原在体外刺激感染者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核分枝杆菌特异的IFN-γ，而非结核分枝杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-γ的量与未用抗原刺激产生的量相近，从而实现诊断的目的。由此可见，寻找并发现结核分枝杆菌特异性抗原，对发展新一代的诊断试剂具有重要价值和意义。

1996年，Stover等通过减数杂交的方法确定了BCG在体外传代过程中丢失的域，定义为缺失区(Region of Difference，RD)，RD区域存在于结核分枝杆菌中，而在BCG和大多数环境分枝杆菌中缺失[程渝,李茂全.结核分枝杆菌的实验室诊断进展.国外医学临床生物化学和检验学分册.2002；23(6)：342-343.]。其中，RD1区域编码的早期分抗原靶6KD(early secreting antigen target 6KD，ESAT-6)和培养滤液蛋白10KD(cμLtufiltrateprotein 10KD，CFP-10)是两种小分子量分泌蛋白，它们是T细胞最主要的抗原之一，可以诱导较强的细胞免疫反应。