[发明专利]一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法

权利要求书

1.一种利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb；

2）构建重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb；

3）将构建好的重组载体pET-22b-HUβ-Lfb和pET-22b-HUβ’-Lfb分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后取含重组质粒的阳性菌株并加入LB液体培养基中过夜培养，接着菌液按1% 比例接种到50 ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD 值为0.6 ～0.8 ；然后加入异丙基硫代半乳糖苷，并放入37℃摇床中诱导表达5小时，摇床转速为180rpm；

4）取诱导表达后的菌液经3000×g离心15min得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，从而筛选到所释放的蛋白具有水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株；

5）将获得的阳性菌液经3000×g离心15min，收集大肠杆菌菌体，于-70°C冷冻放置过夜，备用；将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液B-PER中，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000×g离心15min，于上清液中加入体积比10%的PEI至终浓度为体积浓度0.35%和终浓度0.75 M的 NaCl，4°C放置至核酸沉淀，之后17000×g离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50%，在 4°C放置1h，接着17000×g离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000×g离心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液A，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲液NaCl梯度洗脱，收集0.2 M和0.25 M 的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱及0.25 M NaCl梯度洗脱该洗脱峰，得到HU蛋白原液，将原液进行90℃加热20min后以转速14000×g，4℃下离心20min取上清液即得融合蛋白溶液；加入甘油至其体积分数为50%，-70℃保存待用；

所述步骤1）中构建重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb具体为：取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO： 2所示，将乳铁蛋白肽基因片段直接连接于HU基因片段，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b，对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即得到重组表达载体pET-22b-HUβ-Lfb；

所述步骤2）中的构建重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb具体为：取来源于大肠杆菌U93的HU的1个亚基的基因片段即HUβ亚基和乳铁蛋白肽的基因片段，将HUβ基因片段苯丙氨酸与亮氨酸替换为丙氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；将乳铁蛋白肽序列与修改后Huβ序列连接，使用PCR方法对目的片段扩增，并使用小量质粒提取试剂盒提取质粒Pet22b；对目的片段和质粒进行NedⅠ和EcoRⅠ的双酶切，通过T4连接酶连接，热激法转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-HUβ’-Lfb；

所述步骤5）中，裂解缓冲液B-PER的组分为： 0.05 M Tris、0.2 M氯化钠、0.01 MEDTA、10% v / v甘油、pH 7.5。

2.根据权利要求1所述的利用HU蛋白带动乳铁蛋白肽的表达以及纯化的方法，其特征在于，所述缓冲液的组分：0.02 M Tris、0.001 M EDTA、0.1 M NaCl、10% v / v甘油、pH7.5。