[发明专利]一种基于CoFeB纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药配方的筛选方法。

背景技术

抗生素在杀菌同时，也会造成人体损害，影响肝、肾脏功能、胃肠道反应等。滥用抗生素可能引起某些细菌耐药现象的发生，对感染的治疗会变得十分困难。目前，几乎没有一种抗菌药物不存在耐药现象。开发具有抗菌作用的中药及配方具有积极意义。

许多中药及配方药具有抗菌消炎作用，一些中草药的有效成分和分子结构等也已经全部或部分地研究清楚。例如黄连和黄柏止痢的主要成分小蘖碱（黄连素）、黄芩抗菌的主要成分黄芩素等等。大量事实证明，中国古代劳动人民通过长期实践所积累起来的医药遗产是极为丰富、极为宝贵的。我们应当珍视这个祖国医药学的伟大宝库，努力发掘，加以提高，从中可以开发具有抗菌消炎作用的中药，可以取代或部分取代抗生素。

厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，而不能在有空气存在情况下生长的细菌。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行。它能引起人体不同部位的感染，包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、骨髓炎、腹膜炎等多种疾病。在传统的开发针对某种厌氧菌的中药新配方过程中，一般是在灭菌的培养基中接种厌氧菌后加入中药组分，在特殊的厌氧培养箱中培养。一段时间后再取样进行划线培养，计算菌落数，从而确定某中药组成配方是否有抑菌作用。划线培养也需要在厌氧培养箱中培养，且培养周期至少要几天，因此整个周期长，效率低。本方法是针对上述问题发明的一种中药配方的快速筛选方法。

本方法的基本原理：单克隆抗体或抗原分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。而四元CoFeB材料具有铁磁性，其元素Fe外层具有多个未成对电子，具有高饱和磁化强度，在粒径小到一定程度时，会出现顺磁和超顺磁特性CoFeB纳米材料会对周围水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫时间的影响非常大，具有放大核磁共振驰豫信号的作用。非常微量的CoFeB纳米材料就会造成水的核磁共振弛豫时间大幅下降。因此可以通过构建CoFeB纳米探针，从磁共振的角度来做检测是否存在目标菌，从而间接评估中药成分的抑菌作用。

主要步骤：

1）. CoFeB纳米探针制备。从市场上购买顺磁CoFeB纳米材料，也可以通过其他方法制备纳米级的CoFeB。使用硅烷偶联剂，其通式为:Y(CH₂)nSiX₃。此处，n为0-3；X为可水解的基团；Y为有机官能团。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si(OH)₃)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。通过硅烷偶联剂反应可以得到表面修饰的氨基化或羧基化的CoFeB纳米材料。进一步通过偶联抗体，可实现表面功能化，形成特异性免疫探针，封闭多余的活性位点，离心分离后可以将过量的抗体分离，即可以得到抗性修饰的CoFeB纳米探针。

2）. 采用聚苯乙烯材料制作的样品管进行中药筛选。聚苯乙烯材料与酶标板类似，探针表面抗体会由于吸附作用而结合在聚苯乙烯材料的表面，但是，探针表面的抗体吸附到聚苯乙烯材料表面的速度与探针表面抗体结合目标菌的速度相比，前者速度慢的多，两者是竞争关系。因此，在聚苯乙烯样品管中加入灭菌的厌氧菌的培养基，接种目标厌氧菌后加入需要筛选的中药提取液，密闭厌氧培养一段时间后，加入步骤1）所制备的CoFeB纳米探针，充分混合震荡反应一段时间，若样品管中有目标菌生长，则CoFeB纳米探针表面的抗体首先会与目标菌结合，从而使得CoFeB纳米探针留在液体中。若样品管中没有目标菌，则CoFeB纳米探针表面的抗体会逐渐吸附在聚苯乙烯样品管表面，从而使液体中没有CoFeB纳米探针。前已述及，微量的CoFeB纳米材料就会造成水的核磁共振弛豫时间大幅下降。以无菌的没有接种目标菌的培养基液体为空白，测得的悬浊液的弛豫时间相比有显著降低，则说明液体中含有探针，从而间接证明样品中有目标菌，探针的量与弛豫时间的下降值呈正比，通过加标定量探针可以间接定量出目标菌的量。有目标菌存在，则说明中药抑菌作用不明显，反之则说明有抑菌作用。