[发明专利]高效液相色谱串联质谱检测血清中五种甘氨结合型胆汁酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及胆汁酸的检测领域，尤其涉及高效液相色谱串联质谱检测五种甘氨结合型胆汁酸的方法。

背景技术

甘氨结合型胆汁酸是指胆汁酸以酰胺键(简称肽键)与甘氨酸结合，成为甘氨结合型胆汁酸，包括甘氨胆酸(glycocholic acid，GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)、甘氨石胆酸(glycolithocholic acid，GLCA)、甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid，GDCA)、甘氨熊去氧胆酸(glycoursodeoxycholicacid，GUDCA)。甘氨结合型胆汁酸易溶于水，这是由于其分子中既含有亲水的羟基和羧基，又含有疏水的甲基，且这两种性质不同的基团又完全排列在环戊烷多氢菲核的两侧，使分子分为“亲水”和“疏水”两个侧面。故甘氨结合型胆汁酸具有强乳化剂功能，使肠腔内油脂乳化成微粒，以增加油脂与消化液中脂肪酶(lipase)接触面积而便于脂类消化吸收。甘氨结合型胆汁酸在人体中除了作为乳糜微粒的主要成分外，它还是体内胆固醇消除的一个重要途径，肝脏中新陈代谢的产物可随胆汁排出。甘氨结合型胆汁酸参与脂肪循环，和磷脂形成微粒，并形成乳化液帮助脂肪酸和脂溶性维生素的肠道吸收。尽管甘氨结合型胆汁酸在于肝肠循环，体循环和尿液中含量很低，然而当出现肝胆疾病而致使胆汁酸排泄障碍时，肝内、血液以及尿液中含量显著升高。甘氨结合型胆汁酸能明显诱导肝细胞的凋亡，引起肝细胞的脂质过氧化，激活磷脂酶A2(Spla2)和细胞内钙离子的增加。有研究表明在肝癌中甘氨结合型胆汁酸明显高于正常组织，因此检测检测每一种甘氨结合型胆汁酸的体内水平对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要价值。

分离和定量甘氨结合型胆汁酸及其结合物是一项挑战，因为这类化合物的生化特征各异，有的还存在同分异构体，且它们在人体中的含量较低。目前常规检测方法是循环酶法测定生理溶液中的胆汁酸，虽然操作较为简单，然而该方法只能检测总胆汁酸含量，无法做到测定不同甘氨结合型胆汁酸的差异；气相色谱和气质联用在检测胆汁酸时需要复杂的样品制备，衍生化，需将甘氨结合型胆汁酸水解成非结合型才能进行分析；高效液相色谱串联紫外检测器在检测复杂生物基质中的甘氨结合型胆汁酸会导致灵敏度和特异性不足；荧光检测法则需要复杂的衍生化技术而不能推广。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱串联质谱检测血清中五种甘氨结合型胆汁酸的方法，甘氨结合型胆汁酸检测操作复杂，灵敏度和特异性不足的问题。

本发明的目的采用以下技术方案实现：

高效液相色谱串联质谱检测血清中五种甘氨结合型胆汁酸的方法，包括如下步骤：

(1)标准品的制备：将甘氨结合型胆汁酸标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液，所述甘氨结合型胆汁酸乙腈溶液的浓度范围为2nmol/L～6μmol/L，所述内标为氘代胆酸，氘代脱氧胆酸，氘代熊脱氧胆酸，高速离心后取上清液，上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于高效液相色谱串联质谱上样分析；

(2)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对五种甘氨结合型胆汁酸进行分离；

(3)串联质谱检测：色谱上分离后的五种甘氨结合型胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测五种甘氨结合型胆汁酸，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；

(4)血清中甘氨结合型胆汁酸的检测：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于高效液相色谱串联质谱上样分析；

高效液相色谱串联质谱上样分析步骤同步骤(2)、步骤(3)，液相色谱质谱检测得到甘氨结合型胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中甘氨结合型胆汁酸的含量。

优选的，所述步骤(1)中含已知浓度内标的乙腈溶液浓度分别为：内标氘代胆酸的浓度为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸的浓度为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸的浓度为126nmol/L。