[发明专利]可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用

说明书

本发明公开了可传代培养的羊睾丸细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用，提供了一株可传代培养的羊睾丸传代细胞LT‑1(CGMCC No.12988)以及驯化培养获得该细胞的方法。本发明采用优化的细胞培养液对羊睾丸原代细胞(LT)进行传代驯化培养，可使羊睾丸原代细胞增加传代次数，适于批量生产；并利用该细胞对羊口疮病毒进行增殖培养，结果显示，羊口疮病毒能连续传代培养3代，均能产生明显的病变，病毒含量可达10^7.5TCID₅₀/mL，可用于羊口疮病毒的增殖培养和疫苗制备。

技术领域

本发明属于细胞与组织培养领域中细胞的培养方法和培养体系，特别是涉及一种传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)得到可传代培养的羊睾丸传代细胞(LT-1)的方法及其专用培养体系与应用。

背景技术

目前，羊睾丸细胞(LT)均是来源于羔羊睾丸，经解剖、剪碎、消化、培养而成的原代细胞，该细胞生长缓慢，繁殖一定代数后(一般10代以内)停止生长，传代次数有限，随着传代次数的升高，细胞活力降低，细胞形态也随之越来越差，最后无法进行传代；并且羔羊睾丸来源有限，采集工作量大，易污染，费时费事；细胞制作过程复杂耗时，不利于批量生产使用。

发明内容

为克服羊睾丸原代细胞(LT)培养的不足，实现羊睾丸细胞的批量培养，本发明的发明人长期致力于羊睾丸原代细胞的传代驯化研究，通过个性化的培养基，优化驯化途径，最终获得了一株可以传代培养的羊睾丸细胞。

本发明的第一个目的是提供一株可传代培养的羊睾丸传代细胞，命名为LT-1，该株细胞已于2016年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12988。

本发明的第二个目的是提供一种用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的培养体系。

本发明所提供的用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞的培养体系包括细胞培养液Ⅰ、细胞培养液Ⅱ和细胞培养液Ⅲ；所述细胞培养液Ⅰ为含有10％(体积百分比V/V)新生牛血清和1％-3％(质量体积百分比W/V)L-谷氨酰胺的MEM培养液，所述细胞培养液Ⅱ是含有10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液所述细胞培养液Ⅲ为含有5％(V/V)胎牛血清和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液。

本发明所提供的用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞的培养体系还包括消化液Ⅰ和消化液Ⅱ，所述消化液Ⅰ为0.25％(W/V)的胰酶消化液，所述消化液Ⅱ为含有0.25％(W/V)胰酶和0.02％(W/V)EDTA的EDTA-胰酶消化液。

本发明的第三个目的是提供一种传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的方法。本发明所提供的传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法，是将羊睾丸原代细胞用细胞培养液Ⅰ进行传代培养至7-8代，再逐次用细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养至20代、30代，最后用细胞培养液Ⅲ逐步适应传代至40-50代得到可传代的羊睾丸细胞LT。这里，每次传代培养后用消化液Ⅱ封口，再消化细胞后加入细胞培养液。

具体的，可包括以下步骤：

1)取用公羊睾丸；

2)获得羊睾丸原代细胞：将羊睾丸经清洗、解剖、剪碎，置于放有玻璃珠的三角瓶中，加入消化液Ⅰ，封口，将其放入水浴锅中消化约20-30分钟，取出，加入细胞培养液Ⅰ终止消化，轻轻向一个方向摇动三角瓶，在玻璃珠的作用下，羊睾丸细胞均匀分散开，用无菌纱布过滤，取透过液体，置于细胞瓶中，置于37℃恒温培养箱中培养，由此得到羊睾丸原代细胞；

3)羊睾丸原代细胞的传代：将羊睾丸原代细胞在恒温环境中进行培养，待羊睾丸细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化，取出，加入细胞培养液Ⅰ进行传代培养；