[发明专利]一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒包括多重PCR引物组、2×PCR核心试剂预混物(Premix Taq反应液)、阳性对照(禽结核参考菌株DNA)、阴性对照(ddH₂O)和DL1000分子量标准溶液(Marker)。试剂盒的检测方法包括如下步骤：(1)提供疑试临床待测样品的DNA；(2)按常规PCR方法扩增样品DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，根据扩增条带结果进行判定。该法克服了传统诊断方法中的抗酸染色法敏感性差，生化试验方法程序多、时间长和普通单基因PCR法特异性差的缺点。具有方法特异、操作简便、灵敏度良好的优点，适合对临床疑似的家禽组织样本DNA直接鉴定。

技术领域 本发明涉及一种诊断家禽结核病的多重PCR检测试剂盒及其检测方法，属于兽医微生物学诊断领域。

背景技术

禽结核病(Avian tuberculosis)由禽分枝杆菌感染引起禽的一种慢性传染病。该病呈世界性分布，多呈散发性。该病主要通过消化道和呼吸道感染，呈慢性经过，渐进性消瘦、贫血、鸡冠萎缩、跛行以及产蛋减少或停止。潜伏期约2个月至1年，病禽因衰竭或肝破裂而突然死亡，无明显的季节性和地区性。该病主要特征是禽类肝、脾和肠道等组织器官形成肉芽肿和干酪样结节。一旦传入养禽场，则长期存在，很难根除。世界动物卫生组织将其列为非法定报告动物疫病，我国定为三类动物疫病(关冬梅主编，畜禽结核病及其防制，金盾出版社，2009.6)。

禽结核病的诊断一般通过临床症状、剖检变化和涂片出现抗酸染色可作出初步确诊；但抗酸染色敏感性差，检出率约30％，因此具有一定局限性(Garg et al.,2003)。现最常用的办法是通过选择培养基分离分枝杆菌，再通过生化试验确定，本法结果可靠，但周期较长，生化试验涉及的反应程序较多(陆承平，2001)。常规单基因PCR方法是近年来兽医及生物学领域最有价值的研究手段，技术并不复杂，但技术含量较高。不过，在实际操作中由于扩增因子气溶胶污染产生假阳性(Su et al.,2002；Ritelli et al.,2003刘思国等，2006)。结核菌素皮内变态反应试验(TST)是诊断禽结核病的方法之一，但该法受到PPD的剂量和注射方法的影响大，而且无法区分感染动物与免疫动物(何昭阳等，1994)。

禽结核分枝杆菌种可分为4个亚种，包括禽型分枝杆菌亚种(M.aviumsubsp.Avium)、人/猪型分枝杆菌亚种(M.avium subsp.Hominissuis)、林鸽型分枝杆菌亚种(M.avium subsp.Silvaticum)及副结核分枝杆菌亚种(M.aviumsubsp.Paratuberculosis)。禽结核病主要由禽型分枝杆菌亚种(血清型1，2，3型；其含有特异性基因片段IS901和非特异性基因片段IS1245)引起；也可能由两个禽结核杆菌复合体成员(人/猪型分枝杆菌亚种，血清型1-6，8-11和21；其缺少IS901，含有IS1245)以及禽胞内分枝杆菌(血清型7，12-20和22-28；均缺少IS901和IS1245)引起，或者含有上述菌种的复合感染(OIE，Chapter 2.3.6Avian tuberculosis)。而对于PCR方法，IS901基因片段主要用于检测与毒力有关的禽型分枝杆菌亚种(1、2、3型)及林鸽型分枝杆菌亚种；IS1245是禽结核分枝杆菌4个亚种中均含有的片段；而DanJ是能够感染多种动物及人的禽分枝杆菌复合体成员及禽胞内分枝杆菌种(M.intracellulare)所含有的片段。因此在疑似病变组织及其分离菌体中能同时扩增出这3条典型带(IS901、IS1245和DanJ)说明该菌种系禽分枝杆菌禽亚种(MAA)/禽分枝杆菌林鸽型亚种(MAS)，由于林鸽型亚种主要引起林鸽(wood pigeon)的结核病，因此对于家禽疑似病料组织，一旦多重PCR扩增出3条特异性带，即可判定为禽结核病。

发明内容