[发明专利]高产手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用

说明书

本发明公开了高产手性D‑(‑)‑乙偶姻的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用，构建方法为：(1)在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除ldh基因，pta‑ack基因操纵子，nagD基因和butA基因；在染色体上的乙酸生成pta‑ack位点，插入P_tuf强启动子过表达的合成支路alsSD操纵子；(2)用载体pEC‑XK99E连接合成支路alsSD操纵子得到pEC‑XK99E‑alsSD质粒，删除其lacIq区域,得到pEC‑XK99E‑SD‑△lacIq，导入步骤(1)获得谷氨酸棒杆菌中。本发明菌株安全，用葡萄糖在有氧条件下生产乙偶姻。

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种高产手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用。

背景技术

乙偶姻的化学名是3-羟基-2-丁酮，又叫甲基乙酰甲醇。乙偶姻存在于很多食物当中，有奶香气味，是常用的食品级香料。乙偶姻也是4-C平台化合物的一种，被美国能源部(Department of Energy)列为30种值得优先开发的平台化合物之一。乙偶姻有一个手性碳原子，因此有D-(-)-和L-(+)-两种手性异构体。手性乙偶姻具有较高的产品附加值，能用于医药中间体和手性化合物的合成。一直以来，化学合成法是乙偶姻工业化生产的主要方法包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解和丁二酮的部分加氢等方法。这些工艺虽然操作较为简便，但乙偶姻最终的得率偏低，能耗较大且对环境有一定的污染，而且其所制得的乙偶姻多为两种手性异构体的混合物。

与传统化学合成法相比，乙偶姻的微生物发酵法对环境友好，工艺简单，技术上较为成熟，符合绿色化工的要求。但值得注意的是，目前乙偶姻的生物法制备存在以下三点缺陷。首先，目前乙偶姻的高产菌种很多是病原菌，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、以及阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)等微生物，而大规模工业化生产的安全性原则在很大程度上限制了这些生产菌株的应用，因此迫切需要开发出安全可靠的代谢工程菌株。其次，很多生产乙偶姻的非致病菌种的获得是通过诱变完成，这对菌株的遗传稳定性造成了一定的影响，也为后续通过代谢工程手段进一步改造菌株造成了困难。最后，乙偶姻的产量、得率、生产效率并不够理想，绝大多数乙偶姻高产菌株的产量在60g/L左右。因此，利用代谢工程、辅因子工程、发酵工程和合成生物学方法对模式菌株的代谢途径进行重新设计和合理改造是一种较好的策略。

野生型的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)不能天然生产乙偶姻。但是经过代谢工程等手段改造的谷氨酸棒状杆菌作为乙偶姻的生产菌株具有以下几点优势：1.当乙偶姻用于食品级添加剂使用时，需要保证所使用的菌株为安全的非致病性菌株(Class 1microorganisms)，即GRAS(Generally Recognized as Safe)微生物，而谷氨酸棒状杆菌是一种典型的GRAS菌株，非常适合乙偶姻生物大规模工业化生产，可以有效降低生产环节中用于生防的成本。2.鲁棒性强。作为一种革兰氏阳性菌，其对高浓度底物、纤维素水解液中的有害成分、高浓度盐、酸、醇等的耐受能力较强。3.作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。

经检索，目前有公开发表的文献对谷氨酸棒状杆菌生产乙偶姻的进行了报道，但最终的工程菌株生产乙偶姻的得率、产量、产率等方面也并不理想。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒杆菌菌株。

本发明的第二个目的是提供一种高产手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。