[发明专利]腹泻相关病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒

权利要求书

1.一种腹泻相关病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒用于同时检测以下病原体：腺病毒，星状病毒，诺如病毒GI型，诺如病毒GII型，轮状病毒，沙波病毒，沙门氏菌，志贺氏杆菌，弯曲杆菌，艰难梭状芽胞杆菌，产气荚膜梭杆菌，肠毒素性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，肠致病性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌，肠聚集性大肠杆菌，霍乱弧菌，副溶血弧菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，嗜水气单胞菌，单核细胞增多性李斯特氏菌，阪崎肠杆菌，金黄色葡萄球菌，隐孢子虫，肠贾第虫和痢疾阿米巴虫；

试剂盒内设有腹泻相关病原体的引物组合和探针组合，同时设有人GAPDH基因內源对照以及阳性对照和阴性对照；

其特征在于引物组合为由如下多重特异性保守简并引物组成，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T，各对引物的碱基序列5’-3’如下：

腺病毒，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CAGACAGGTCRCAGCGACTG，

反向引物：Cy5-5’-AAGTAGGTGCTGGCCATGTC；

星状病毒，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：TRGARCACTGCCTNTCDCGGAC，

反向引物：Cy5-5’-YRGRCTTRCTAGCCATCRCAC；

诺如病毒GI型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCARGCCATGTTCCGYTGGA，

反向引物：Cy5-5’-GCGTCYTTAGACGCCATCATCAT；

诺如病毒GII型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CTGGCTCCCAGYTTYGTGAA，

反向引物：Cy5-5’-CAATRGCRGCACCRRCWACG；

轮状病毒，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CCATCTWCACATGACCCTCTATGAGC，

反向引物：Cy5-5’-ACGSCCCTATAGCCATTTAGGT；

沙波病毒，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CCCTCCATYTCAAACACTA，

反向引物：Cy5-5’-VAAYTWYGAYYWGGCYCTCG；

沙门氏菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GYACGATATTCAGTGCGATCAGGA，

反向引物：Cy5-5’-TTAACAGTGCTCGTTTACGACCTG；

志贺氏杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GGCCTTCCAGACCATGCTCG，

反向引物：Cy5-5’-CAGTGCGGAGGTCATTTGCT；

弯曲杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：TGAGTGCTATTAAAGGYATTGATKTRGGT，

反向引物：Cy5-5’-CCATAATGKCCAAATCCWCCRCTT；

艰难梭状芽胞杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCACCATCAATAACATATAGAGAGCCAC，

反向引物：Cy5-5’-CCAAGCAAATACTCTATTTGGAGCATTAGG；

产气荚膜梭杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CCAGYCATAAARTCATTTCCTGGGT，

反向引物：Cy5-5’-TCAACTAGTGGTGARAAAGATGCTGG；

肠毒素性大肠杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：ACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCA，

反向引物：Cy5-5’-GGTGCATGATGAATCCAGGGT；

肠出血性大肠杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CAAAGACGTATGTAGATTCGCTGAATGTC，

反向引物：Cy5-5’-ACTATCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCC；

肠致病性大肠杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GGATTTTTCTGGTGATAATACCCGYTTAGG，

反向引物：Cy5-5’-AGTCTTTCTTRTTGTATGACTCATGCCA；

肠侵袭性大肠杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GTAGACATAGGTTCTTCTGTT，

反向引物：Cy5-5’-GTTGCCCCACGCTGGTTGTC；

肠聚集性大肠杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CCATTTATCGCAATCAGATTAARCAGCGA，

反向引物：Cy5-5’-GCTACAATTATTCCTTTTGACCAATTCGGA；

霍乱弧菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GGCCCAACGTCCAAACGAGG，

反向引物：Cy5-5’-TCGAAATGGCTTGGGTTAAGCT；

副溶血弧菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CGAAGTTGTACGATTAGGAAGCAACG，

反向引物：Cy5-5’-ACGCCAAACAAACTCGTGAAGCT；

小肠结肠炎耶尔森氏菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：TYAGTGAGAACCAGTATTCCGCT，

反向引物：Cy5-5’-CTGGTCGCGGCACAATTGGT；

嗜水气单胞菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：MGAGCTCTACAAGGCYGAYATCTC，

反向引物：Cy5-5’-TRACGAAGGTGTGGYTCCAGTTCG；

单核细胞增多性李斯特氏菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CAGCATCTCCGCCTGCAAGTC，

反向引物：Cy5-5’-TTCTTGGCGGCACATTTGTC；

阪崎肠杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：AAGTMTTCGKGCTGCGAGTT，

反向引物：Cy5-5’-TTGCTCTYTAACAATCCGGAACAAGCT；

金黄色葡萄球菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：TKTTTYGAAAGRRCAATACRC，

反向引物：Cy5-5’-GTGATGCATYTGCTGAGCTAC；

隐孢子虫，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCTGAATTAGAATCGACATGCCCA，

反向引物：Cy5-5’-GGTGGRCATTCYTTTGCAGGA；

肠贾第虫，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CAGACGTGGAGTCTGCGGCT，

反向引物：Cy5-5’-GCYCGTTGTCGCARTGGAGC；

痢疾阿米巴虫，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GGGAGCTTTACAGATGGCTACCA，

反向引物：Cy5-5’-GCCCTCCAATTGATTTCGTAGGAGAA；

內源对照GAPDH基因，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：ATCTTCCAGGAGCGAGATCC，

反向引物：Cy5-5’-AGGGGGCAGAGATGATGAC；

并且，所述探针组合为顺序固定于基因芯片表面的如下所示核酸探针，包括腹泻相关病原体特异性保守简并探针、GAPDH內源对照探针，阳性杂交点探针和阴性杂交点探针，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T，各探针的5’端做氨基标志，各条探针的碱基序列5’-3’如下：

腺病毒探针：

NH2-5’-GAMACCGCYTAYTCTTACAAAGTGCGCTTTACGCTGGCCGTGGGCGACAAC CGGGTKTT；

星状病毒探针：

NH2-5’-TGYDAAGCAGCTTCGTGANTCTGGHYTNCCDGCYAGRCTCACWGAAGAGC AACTYCATC；

诺如病毒GI型探针：

NH2-5’-GCGNTTCCAYGAYYTNRGNYTDTGGACAGGRGAYCGCRATCTBYTRCCCGA WTWYGTRA；

诺如病毒GII型探针：

NH2-5’-GAAGATGGCGTCGARTGACGCCARCCCATCTGATGGGTCCRCRGCCARCCT YGTCCCAG；

轮状病毒探针：

NH2-5’-CCATCTWCACATGACCCTCTATGAGCRCAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCA AAAACCT；

沙波病毒探针：

NH2-5’-TTTGKKDGYHYCTTCABTGKRRCBVHCTKGVHCNRKNVCTGYACCRCCTAT RAACCADG；

沙门氏菌探针：

NH2-5’-AATCAACCAGAWAGGTAGGTAATGGRATGACGAACATAGAAATGATCATCA CCATTAGT；

志贺氏杆菌探针：

NH2-5’-GAAACTTCAGCTCTCYACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTC GGGAGTGA；

弯曲杆菌探针：

NH2-5’-TTYTATGGTTTAGCWGGTGKRGGATATGARGATTTTTCWAAWGSYGCTTWT GATAATAA；

艰难梭状芽胞杆菌探针：

NH2-5’-ATGACGTATTGGAAGTACAAAAAGAAGAACTTGATTTGTCAAAAGATTTAA TGGTATTA；

产气荚膜梭杆菌探针：

NH2-5’-CCCATTCTTGAGTTTTTCCATCCTTTGTTTTGATTCCAAARTACATGTAGTCA TCTGTT；

肠毒素性大肠杆菌探针：

NH2-5’-GAGGATGGTTACAGATTAGCAGGTTTCCCACCGGATCACCAAGCTTGGAGA GAAGAACC；

肠出血性大肠杆菌探针：

NH2-5’-TAGATTCGCTGAATGTCATTCGCTCTGCAATAGGTACTCCATTACAGACTATT TCATCA；

肠致病性大肠杆菌探针：

NH2-5’-TGGSGAATACTGGCGAGACTATTTCAAAAGTAGYGTKAACGGCTATTTCCGC ATGAGCG；

肠侵袭性大肠杆菌探针：

NH2-5’-TTATTTCCTTATGTTCAAGGAAATAATTGTTGGCCTCCTTCTCTCTTTTTGCTT GTCTC；

肠聚集性大肠杆菌探针：

NH2-5’-CGCCTAAAGGATGCCCTRATGATAATATACGGAATATCAAAAGTAGATGCTT GYAGTTG；

霍乱弧菌探针：

NH2-5’-CTCGCAATGATTTGCATGACTTTGTTTGGCGAGAGCAAGGTTTTGAAGTCGA TGATTCC；

副溶血弧菌探针：

NH2-5’-AAAGCCGTATACTCCTGATGTTGGCGGAGAGACCAAACGAAGTTTTAACCC GTAACGAG；

小肠结肠炎耶尔森氏菌探针：

NH2-5’-CACCAAAACCTTTCACTGATATGTAGTTGAGTAAAAACATCAGGGCGAGGA ACARCGCA；

嗜水气单胞菌探针：

NH2-5’-VCTGAGYGGYTTCCTGCGYTGGGGYGGCAAYGCCTGGTAYACCCAYCCGG ACAAYCGYC；

单核细胞增多性李斯特氏菌探针：

NH2-5’-CCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGRTTG GAYTAYAA；

阪崎肠杆菌探针：

NH2-5’-CAYACCGCGMATHCCTKWTTACSGARRAATRCRGCAGCRTGTCTGTTTCAA TTTTCAGC；

金黄色葡萄球菌探针：

NH2-5’-AGAGGTTTTTCWWWTTCRCTACTAGTTGYTTAGTGTTAAYTTTAGTTGTAG YTTCAAGT；

隐孢子虫探针：

NH2-5’-ATTCRATATTTGAAAATGGAAAATGTAAAGTGATTAAAAATATTGATATGGTC TGCCCA；

肠贾第虫探针：

NH2-5’-TGACTCAACGCGYGCACCTCACCAGGCCCRGACGCGCGGAGGACCGACAG CCGGGYGCG；

痢疾阿米巴虫探针：

NH2-5’-CGACACATAACTCTAGAGTTGAGTAAAATCAATTCTTGAAGGAATGAGTAG GAGGTAAA；

內源对照GAPDH基因探针：

NH2-5’-TCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACT GGCGTCTT；

阳性杂交点探针：

NH2-5’-CCCTCGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCG GAGATGG；

阴性杂交点探针：

NH2-5’-GATCGTCGTTGGGCTTTAGATTTCTCTTATAGGCTCGGTCGGCGCCTCTCGC CCCGAGC。