[发明专利]微生物发酵生产N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖和/或D‑氨基葡萄糖盐的方法

权利要求书

1.一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：

A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰，优选同时包含至少一种能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰；和

B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

优选，进一步包括C)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。

进一步优选，所述盐选自盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐。

2.如权利要求1所述的方法，其中，提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰选自a)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；和/或b)微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶被过量表达；

优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。

3.如权利要求2所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化。

优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。

进一步优选，重组核酸分子中编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因拷贝数增加。

进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。

4.如权利要求2所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰。优选，编码D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。

5.如权利要求1所述的方法，其中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性降低；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达减少；

优选，微生物用至少一种包含至少一种能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。

进一步优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的内源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子的部分或完全缺失、或部分或完全失活；更优选，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰为编码微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因的内源性天然启动子完全缺失，即被删除。

6.一种通过微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和/或D-氨基葡萄糖盐的方法，该方法包括：

A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)作用的遗传修饰，并同时包含至少一种能降低D-氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶(NagB)作用的遗传修饰；和

B)收集从培养步骤A)中产生的N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

优选，进一步包括C)由N-乙酰-D-氨基葡萄糖脱乙酰化得到D-氨基葡萄糖盐。

进一步优选，所述盐选自盐酸盐、硫酸盐、钠盐、磷酸盐和硫酸氢盐。

7.如权利要求6所述的方法，其中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰选自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的酶活性增加；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶被过量表达；

优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。