[发明专利]一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法

权利要求书

1.一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）斜带石斑鱼个体DNA提取

取斜带石斑鱼个体鳍条，采取酚-氯仿法提取基因组DNA；

（2）斜带石斑鱼多态性微卫星引物的筛选

用步骤（1）获得的基因组DNA为模板，筛选8对微卫星引物，所述8对微卫星引物分别为M3-134，M4-44，M2-16，M2-64，M4-138，M4-116，M3-118和M3-33，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.16所示；

（3）斜带石斑鱼8重PCR条件的优化和扩增

每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，设计8重PCR反应体系和反应程序，进行8重PCR扩增；

（4）亲子鉴定

将8重PCR产物在测序仪上进行分型，读取个体等位基因大小bp，即碱基对，排成数字基因型矩阵，读取亲本及子代基因型后，根据孟德尔定律判断亲子关系。

2.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（1）中将基因组DNA稀释至100ng/μL。

3.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（2）中筛选8对微卫星引物的过程是：根据已发表的斜带石斑鱼微卫星标记，合成引物，并分别对30个野生斜带石斑鱼个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高并且具有相同退火温度的8对微卫星引物。

4.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（2）中相邻两对引物扩增出的片段大小范围不相同。

5.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（3）中M2-16、M4-138、M3-118标记荧光物质FAM，M3-134、M4-44、M2-64、M4-116、M3-33标记荧光物质HEX。

6.根据权利要求1或2所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（3）中所述8重PCR反应体系如下：浓度为10 μmol/L 的M3-134 0.5μL，浓度为10μmol/L 的M4-44 0.3μL，浓度为10μmol/L 的M2-16 0.4μL，浓度为10μmol/L 的M2-64 0.5μL，浓度为5μmol/L 的M4-138 0.6μL，浓度为5μmol/L 的M4-116 0.6μL，浓度为5μmol/L 的M4-118 0.5μL，浓度为5μmol/L 的M3-33 0.5μL，浓度为100ng/μL 的Organization DNA 3μL，ddH₂O 6.1μL，GenStarTaq PCR StarMix 12μL，总计25μL。

7.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(3)中8重PCR反应程序设定为：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。

8.根据权利要求1所述的斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤(4)中采用ABI 3730XL进行基因型分型，利用Gene mapper v4.0读取个体等位基因大小bp。