[发明专利]一种用于测定野外根际土壤原位酶谱的设备及方法

说明书

本发明涉及土壤微生物学、土壤化学、生态学、分子生物学、环境科学、自然地理学、全球气候变化等多学科领域，具体提供了一种用于测定野外根际土壤原位酶谱的设备，以及使用所述设备测定野外根际土壤原位酶谱的方法。通过本发明的设备和方法，本发明可以成功实现野外根际土壤原位酶谱测定，快捷方便，可用于根系、凋落物、土壤动物、生物孔隙等对土壤碳、氮、磷循环相关胞外酶活性影响的研究。

技术领域

本发明涉及土壤微生物学、土壤化学、生态学、分子生物学、环境科学、自然地理学、全球气候变化等多学科领域，具体提供了一种用于测定野外根际土壤原位酶谱的设备及方法。

背景技术

土壤胞外酶参与无数生物化学过程，是陆地生态系统土壤有机物周转、养分循环的驱动因素。大多数胞外酶被认为来自微生物，然而植物根系和土壤动物通过直接产生酶，或者间接释放刺激微生物生长的有机底物，对胞外酶的丰度有很大影响。土壤胞外酶存在于高异质性环境中，因此许多由其驱动的土壤过程表现出高空间异质性。土壤中的根际和生物孔隙因具有较高的微生物活性，被认为是明显区别于非根际土壤的微生物“热点区域”。然而，目前由于受分析微生物酶活性空间分布和酶活性“热点区域”的仪器和方法限制，还难以实现对野外根际土壤或生物孔隙进行原位酶活性监测。

国际上酶活性分析经历三个主要阶段。第一阶段为从1950年至今，为传统酶活性分析方法，采用容量瓶培养土壤样品，比色法测定酶活性，该方法所用样品、试剂量大，培养时间长，分析效率低，获得数据较少。第二阶段为21世纪初，美国开发了应用荧光物质作为底物，在96孔板中培养，用高通量酶标仪测定酶活性技术。该方法样品用量少，试剂消耗量少，培养时间短，高通量分析效率高，为快速、高效分析酶活性及动力学特征、温度敏感性等提供技术支持，并在土地利用管理措施、土地利用变化、气候变化对土壤胞外酶活性及其动力学特征的影响方面进行应用。然而，上述两种方法均采用野外破坏性采样-室内分析，无法对酶活性进行原位监测，仅能提供一维的酶活性结果，难以反映酶活性的空间分异特征。第三阶段为2013年德国哥廷根大学研发的原位酶谱法，原位酶谱法结合蚯蚓盒等培养方法，用荧光标记底物在原位与酶反应，可以获得动物孔隙中土壤酶活性空间分布特征。酶谱法中底物介质也在不断改进，由原位凝胶酶谱法向直接酶谱法改变。

2013年，德国哥廷根大学Yakov Kuzyakov团队利用原位凝胶酶谱法，定位和量化生长于根盒中多叶羽扇豆根际土壤蛋白酶和淀粉酶活性，发现与根系相连的区域酶活性最高，认为土壤原位酶谱法具有较高的分析效率，是绘制土壤酶活性空间分布的有效工具。但是，存在的问题是，由于在使用凝胶作为底物介质的酶谱法中，酶或底物扩散到凝胶中会使“热点区域”焦点变模糊。减小凝胶厚度只能减少却无法消除扩散问题。2016年德国哥廷根大学Yakov Kuzyakov团队又发展了土壤原位酶谱法(直接酶谱法)，及底物不需要凝胶介质，将被底物饱和的纤维膜直接与土壤剖面接触，研究玉米根际土壤中β-葡萄糖苷酶活性的空间分布，发现“热点区域”中的β-葡萄糖苷酶活性比非根际土壤高了近20倍，认为直接酶谱法能够绘制根系-土壤界面酶活性的二维分布，可用来评估与根系相连的酶谱分布特征。

利用酶谱法结合室内培养实验，Yakov Kuzyakov团队研究了根系、土壤动物对酶活性空间异质性的影响。例如，利用室内根盒培养实验，选择两种生理功能和根系形态不同的植物—小扁豆(主根根系、固氮豆科作物)和玉米(须根根系、非豆科作物)，结合原位酶谱法，检测这两种作物根际土壤β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、亮氨酸氨基肽酶和磷酸酶活性的空间分布，发现玉米根尖的酶活性较高，而小扁豆根系酶活性的分布相对均匀。蚯蚓生境内部的可视化是一种挑战，通过室内蚯蚓盒培养实验，第一次通过原位酶谱法可视化蚯蚓孔隙内土壤β-葡萄糖苷酶、几丁质酶和磷酸酶活性的空间分布，发现孔隙中“热点区域”的酶活性比对照土壤高2.4-14倍，该方法直观的显示了蚯蚓孔隙是微生物“热点区域”。

综上所述，原位酶谱法可以成功区分根际、生物孔隙土壤酶活性空间异质性，但目前国际上还没有适用于野外开展原位酶谱法监测仪器，只有室内简单的暗室-荧光-相机组件，还有待研发成一套便于野外应用的监测仪器和技术，实现野外原位监测与酶谱影像数字化的综合功能。