[发明专利]一种检测六种鸭易感病毒的多重PCR方法

说明书

本发明公开了一种检测六种鸭易感病毒的多重PCR方法，包括以下步骤：基因组准备；引物设计与合成；引物特异性检测；多重PCR体系建立；多重PCR特异性检测。本发明建立了可在单一反应体系中快速鉴别诊断鸭的6种常见病毒的m‑PCR方法，在国内外属首次报道。由于此方法所需检测时间短，特异性强，准确性好，敏感度较高，可普遍适用于临床上鸭病毒感染样品的快速鉴别诊断。

技术领域

本发明属于流行病学技术领域，具体地说，涉及一种检测六种鸭易感病毒的多重PCR方法。

背景技术

病毒性传染病是危害鸭群的重要疾病。近年来养鸭业规模的扩大、混合养殖模式的增多、人畜的流动性增强、水源污染造成的水质下降等多方面因素为病毒的传播创造了有利条件，地方流行的病毒性疾病明显增多，新的疫情不断发生，给养鸭业造成了严重经济损失。目前，感染鸭的主要病毒有1型鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒和鸭H9N2低致病性禽流感病毒等，建立能够普遍适用这些病毒感染的快速检测方法，以今早采取防治措施，减少经济损失是困扰养鸭业的重要问题。

临床上，病毒分离鉴定、血清学检测、免疫电镜、ELISA、Real-time PCR、LAMP和普通PCR等技术已被分别应用于这些病毒感染的检测，但是病毒分离鉴定耗时长，血清学和ELISA检测耗时费力，免疫电镜和Real-time PCR对设备及病毒的纯化要求较高，均给临床诊断带来了局限性。PCR检测技术灵敏度高、简便、快速、安全、易于推广，无需分离病毒即可检测，Real-time PCR、LAMP和普通PCR已在鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、H7亚型流感病毒、番鸭细小病毒和鸭瘟病毒的检测中被报道应用，但不能鉴别诊断其他病毒。多重PCR(multiplexPCR，m-PCR)，是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，过程和原理与普通PCR相同，但是具有普通PCR不可比拟的优势。在病毒性疾病检测和鉴别诊断方面，m-PCR可同时检测、鉴别出多种病毒，是临床上快速诊断病毒混合感染的有效方法。目前国内外尚无鸭常见病毒性疾病m-PCR的报道，

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测六种鸭易感病毒的多重PCR方法。通过比对不同病毒蛋白的相关基因序列，根据保守区序列设计无交叉扩增的特异性引物，建立普遍适用于临床上鸭病毒感染样品快速检测的m-PCR方法。

其具体技术方案为：

一种检测六种鸭易感病毒的多重PCR方法，包括以下步骤：

步骤1、基因组准备

按照Viral RNA/DNA Extraction Kit试剂盒说明书分别提取6种病毒已有毒株基因组RNA/DNA，无核酸酶超纯水溶解后分光光度计测定浓度与纯度；将DHAV-1、DTMUV、ARV及H9N2的RNA按照MMLV说明书反转录为cDNA，所有DNA/cDNA置于-80℃保存备用；

步骤2、引物设计与合成

分别比对DHAV-1、DPV、DTMUV、MPDV、ARV、H9N2这6种病毒在Genebank中已公布的蛋白序列与实验室已有毒株的病毒蛋白序列，选择保守区域利用Primer Premier V5.0和Oligo V6.22软件进行引物的评价和筛选，设计特异性引物SEQ ID NO:1-12所示，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；

步骤3、引物特异性检测