[发明专利]一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及生物、化学和药品领域，特别涉及羟基酪醇脂质体的制备方法。

二、背景技术

脂质体主要是由类脂材料组成的双分子层空心小球，同时具有亲水性和疏水性两种性质，因此既能包封脂溶性物质又能包埋水溶性物质。将类脂材料分散于水中时，水溶性物质会自发地分布在脂质体的内部，而脂溶性物质分布在脂质体的亲脂端。脂质体的制备方法主要有：薄膜分散法、超声波分散法、冻融法、乙醇注入法、逆相蒸发法等。其理化性质的评价指标主要有：脂质体平均粒径及其粒径分布、包封率、物化稳定性等。制备的脂质体具有靶向性、缓释性、保护性、低剂量、长效性、低毒性等优点。

长循环脂质体又称长效脂质体，是一种表面含有天然或合成聚合物修饰的类脂衍生物的新型脂质体。在血液中驻留时间延长，从而延长药物作用时间，具有长效作用。常用的修饰物有聚乙二醇(PEG)和神经节甘酯(GM1)。GM1增强膜刚性，减少单核吞噬细胞系统(MPS)的摄取，这种长循环脂质体在血液中的滞留量与被MPS摄取量的比值高于传统脂质体几十倍。但GM1难以大量获得，且有一定的免疫毒性。含有PEG的类脂衍生物，它们在脂质体表面具有高度修饰的作用，能形成空间位阻层，这种立体位阻能够保护脂质体不被识别、摄取，使其消除减慢，作用时间延长。

油橄榄中包含大量的多酚类化合物，如橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等。尤其是羟基酪醇(3，4-二羟基苯乙醇，Hydroxytyrosol，简称HT)，清除自由基的能力强，表现出独特的生物和药理活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流、有效地抑制由丙烯醛造成视网膜上皮细胞的氧化损伤和线粒体功能失调，保护软骨和抗骨质疏松等。而且HT还能抑制人类早幼细胞白血病细胞HL-60、结肠癌细胞HT-29、女性乳腺癌细胞MCF-7等扩散，透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，具有很好的抗癌活性。尽管HT有诸多生物和药理活性，已逐渐引起研究者的关注。但是，HT含有3个酚羟基，暴露在空气中极易被氧化，性质很不稳定。且亲水性强，难以更好地溶于细胞膜结构以增强其功效性。如果将HT制备为脂质体后，不但能保护其不受外界环境因素的影响提高稳定性，还能增强其生物利用度(抗癌、抗菌、抗氧化等生物活性)。

国内外的文献报道了从油橄榄叶或橄榄果提取分离橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等多酚类化合物，但目前采用橄榄叶提取油橄榄多酚提取物大多是10～40％橄榄苦苷提取物，羟基酪醇含量小于10％，毛蕊花苷低于5％，限制油橄榄多酚活性的多功能开发。

三、发明内容

为了解决橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等高活性多酚稳定性与生物活性，本发明找到一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物复合方法，并且加工成长循环脂质体，因此，本发明的技术方案是采用如下步骤来实现：

第一步：油橄榄多酚提取物制备

取油橄榄叶，加入30～50％乙醇提取，油橄榄叶与30～50％乙醇质量体积比(kg∶L)1∶5～20，提取两次，温度70～85℃，合并提取液，滤液过陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000Da超滤膜，再用纳滤膜浓缩滤液，滤液过纳滤膜，橄榄叶与浓缩滤液质量体积比(kg∶L)1∶1～3，浓缩液真空干燥，粉碎成粉制成油橄榄多酚提取物，HPLC分析，其中橄榄苦苷10～40％，毛蕊花苷3～6％，羟基酪醇2～7％，水溶性为100mL水溶解2～8g；

第二步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物制备

将90％羟基酪醇与10～40％橄榄苦苷提取物及90％毛蕊花苷复配，按质量比例为4～8∶2～5∶1～3，加入3～8倍无水乙醇，60～90℃加热回流10～30min，样品充分溶解后过滤，减压浓缩，制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物，其中羟基酪醇为50～70％，橄榄苦苷为10～20％，毛蕊花苷为5～15％；

第三步：薄膜分散-机械振荡法制备长循环油橄榄多酚脂质体

以富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物为包封目标，设计温度40～70℃、卵磷脂与胆固醇质量比为1∶1～8∶1，称卵磷脂与胆固醇质量3～10g，表面活性剂吐温-80体积2～10mL，PEG 200 1～5g，放人圆底烧瓶中，加入适量有机溶剂，超声振荡5～20min，溶解后减压薄膜蒸发除去溶剂，再加入1～4mg/mL羟基酪醇(HT)水溶液1～10mL，油橄榄多酚水溶液1～3mL，旋转洗膜水化时间5～50min，再超声溶解5～30min可得到脂质体。根据单因素与正交设计优化，制备均匀的乳白色长循环脂质体，具有稳定性、缓释性、抗氧化性和抑菌性等功能；