[发明专利]一种珍珠母蛋白N16的制备方法

权利要求书

1.一种珍珠母蛋白N16的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)利用PCR法扩增N16基因，扩增所得N16基因连接到表达载体pET32a上，并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysE，涂布于平板并挑取表达效力高的单克隆，用于表达N16蛋白；

(2)优选单克隆，接种至基础培养基培养，作为种子培养基；

(3)再将种子培养基接种于发酵体系基础培养基，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导N16表达，收集表达菌体；

(4)分离纯化步骤：将表达菌体在pH 6.5～8.5的条件下进行包涵体分离，经凝胶排阻层析纯化得珍珠母蛋白N16。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述发酵体系的生长条件为pH5.0～9.0，温度为25～37℃，初始溶氧浓度50％～150％，并以乳糖溶液作为补料碳源，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入0.1～1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:骤(3)所述发酵体系的生长条件为pH7.0，温度为37℃，初始溶氧浓度100％，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述发酵体系的乳糖溶液配方为1L乳糖溶液中含乳糖10～200g，MgSO₄·7H₂O 1～10g。

5.如权利要求1或2或3或4所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述的发酵体系基础培养基配方为1L基础培养基含酵母粉1～10g，NZ胺1～10g，NaCl 1～10g，MgSO₄·7H₂O 1～10g，酸水解酪蛋白1～10g，乳糖1～10g，KH₂PO₄ 0.1～10g。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述的发酵体系基础培养基配方为1L基础培养基含酵母粉5.0g，NZ胺10.0g，NaCl 5.0g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，酸水解酪蛋白1.0g，乳糖5.0，KH₂PO₄ 0.75g。

7.如权利要求1或2或4所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述种子培养基接种于发酵体系基础培养基的接种比例为：种子培养基按0.1～10％(v/v)比例接种于1～10L基础培养基。

8.如权利要求1或2或4所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)所述PCR法扩增N16基因的反应程序为：90～100℃下反应0.5～2分钟，45～60℃下反应20～60秒，72℃下反应0.5～2分钟，共20～40个循环；最后65～75℃下反应5～15分钟。

9.如权利要求1或2或4所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的种子培养基的制备方法为，优选单克隆至基础培养基，25～37℃摇床培养，使其生长至OD₆₀₀为0.1～1.0；所述的基础培养基为NZ培养基，其配方为：1L的NZ培养基含酵母粉1～10g，NZ胺1～10g，NaCl 1～10g，MgSO₄·7H₂O 1～10g，酸水解酪蛋白1～10g。

10.如权利要求1或2或4所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)所述的分离纯化步骤具体为：以0.01～1M Tris-HCl作为分散液将表达菌体分散，超声破碎，离心，弃上清液，收集不溶物A以洗涤缓冲液超声溶解，离心，收集不溶物B，再以溶解缓冲液溶解不溶物B，离心，取上清液，滤膜过滤，以凝胶排阻层析柱分离纯化得目标产品N16；其中，所述洗涤缓冲液由1～3M尿素,0.01～1M Tris配制，pH为6.5～8.5；所述的溶解缓冲液由7～8M尿素,0.01～1M Tris,和5～40mMβ-巯基乙醇配制，pH为6.5～8.5；所述凝胶排阻层析柱分离的流动相由7～8M尿素,0.01～1MTris,5～40mMβ-巯基乙醇配制,pH为6.5～8.5。