[发明专利]一种用于检测电子烟制品对细胞脂质过氧化影响的方法

权利要求书

1.一种用于检测电子烟制品对细胞脂质过氧化影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)受试物的前处理；

(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；

(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；

(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；

(5)受试物的分组；

(6)受试物检测剂量的设定；

(7)受试物培养品的制备；

(8)受试物的孵育；

(9)受试物孵育品的收集；

(10)受试物孵育品的裂解离心；

(11)标准品的配制；

(12)受试物样品的测定；

(13)丙二醛含量计算。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为10～90％的比例进行混合稀释后，放置24h-48h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，-80℃保存待用；

(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6mL，将细胞培养皿置于37℃、5％vtCO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；

(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5个非零剂量：25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL；

(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中100mm细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用成纤维细胞培养基将每孔中的液体体积补足到6mL；

(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的100mm细胞培养板置于37℃、5vt％CO₂培养箱中孵育24h；

(9)受试物孵育品的收集：去除步骤(8)中的培养基，用磷酸盐缓冲液PBA洗一遍，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维细胞培养液悬起，1000rpm低温离心10min；

(10)受试物孵育品的裂解离心：收集(9)步骤得到的细胞，加入100μL细胞裂解液，裂解后收集细胞，1600rpm低温离心10min，取上清液待后续测定；

(11)标准品的配制：取适量丙二醛标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于制作标准曲线；

(12)受试物样品的测定：在不同离心管内加入0.1mL步骤(10)制备的样品待测液、不同浓度梯度的标准品稀释液，随后分别加入0.2mL浓度为0.185mg/mL的硫代巴比妥酸、丙二醛检测工作液混匀后100℃沸水浴15min，1000g室温离心10min，取200μL上清液加入96孔板中，酶标仪532nm测定吸光度；

(13)丙二醛含量计算：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算丙二醛含量。