[发明专利]一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法

说明书

本发明涉及一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法。所述的配对微流控芯片为高通量捕获单微球/单细胞的微流控芯片，所述的方法包括：a、高通量配对捕获单微球/单细胞；b、对配对单元平行操控，如对大量单细胞的隔离、培养、裂解等，单细胞各种内含物的捕获等；c、通过编码微球将单细胞内含物信息转化为DNA序列信息，利用高通量测序技术和生物信息学方法分析大量单细胞内含物，如转录组、基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。本方法可以全面完整的分析单细胞内含物信息，具有通量高，准确性高，成本低，可分析靶标广等优点。

技术领域

本发明涉及分子细胞生物学，具体涉及一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的技术。

背景技术

分析细胞内含物是分子生物学研究的基础，也是现代医疗诊断的分析靶标。传统分析细胞内含物的方法对大量细胞平均信号的分析处理使得信号的平均化模糊了人们对单细胞之间异质性的认识。目前前沿生物学研究和医学研究表明，同一个体的不同组织之间，同一组织的不同部位之间，以及同一部位的不同细胞之间都存在异质性(heterogeneity)，即使是同一种细胞的不同个体之间也可能存在很大的异质性，这差异最大的这些细胞往往能够揭示重要生物学现象或者提示癌症等重大疾病。因此单细胞的全面分析是现代生物学和医学研究十分需要的技术。

对单细胞分析来说，其面临的挑战主要有三点，首先是快速高效地分离单细胞，防止单细胞的丢失；其次是由于单细胞中所含有的分析靶标量太少，如何无偏放大靶标的信号，减少或者消除放大偏差性，真实反应细胞内含物的表达水平；再次是提高单细胞分析的通量，减少重复操作，提高效率；最后是如何实现单细胞内含物的全面分析，分析各种内含物的表达量以及相互之间的关联。

目前尚无能够将高通量捕获单细胞、无偏扩增微量单细胞内含物、全面分析单细胞内含物集成在一起的公开技术。但已有公开报道利用微流控技术高通量分析单细胞转录组。比如Cell文章(Macosko et al.，2015,Cell：161，1202-1214；Klein et al.,2015,Cell161,1187-1201)报道的结合液滴微流控和编码微球的方法，基于泊松分布原理利用液滴微流控的方法配对捕获单细胞与单微球，单细胞裂解释放的mRNA被与之配对的编码微球捕获，再经过逆转录和扩增，将单细胞mRNA信息编码与放大，通过高通量测序与生物信息学方法分析大量大细胞mRNA的表达情况。该方法中细胞与微球的捕获是基于泊松分布原理，大部分的液滴没有细胞，只有～1％的液滴含有单个细胞，再结合微球的泊松分布，有效分析目标进一步减少，只能实现对大量实际样品中少部分细胞的分析，这样可能会忽略掉样品中一些重要的细胞个体。另外该策略只适合分析对象数目较多的样品，对于一些稀有细胞(比如循环肿瘤细胞)，由于其样品中细胞数量太少(10-100/mL血液)，无法用该方法来实现单细胞分析。这些技术都仅限于分析单细胞的mRNA，其他单细胞内含物无法进行分析，如基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。目前公开的技术中，都没有涉及到高通量分析。

发明内容

针对现有技术的缺陷，为了解决以上问题，本发明的目的在于：利用申请人发展的配对微流控芯片，基于流体力学原理和尺寸效应高通量捕获单细胞，结合编码技术和高通量测序技术，提供一种高通量分析单细胞内含物的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明公开了一种利用配对微流控芯片高通量分析单细胞内含物的方法，所述方法包括步骤：