[发明专利]一种共抑制油菜FAD2和FAE1基因表达提高菜籽油营养品质的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术邻域，涉及一种共抑制油菜FAD2和FAE1基因表达提高菜籽油营养品质的基因改良技术方法。

背景技术

油菜是世界上最重要的油料作物之一，其油产量在世界油料作物中于棕榈、大豆之后位列第三(http://usda.mannlib.cornell.edu/usda/ers/89002/表47.xls)。高品质的压榨菜籽油是食用油的主要来源。此外，菜籽油也是生物柴油燃料和工业原材料的重要来源。为了满足日益增长的油料生产的需要，遗传改良油菜来提高油含量及油的品质变成一项重要任务。

油料种子的营养品质通常由脂肪酸平衡和蛋白含量决定。脂肪酸图谱，典型来讲，包括软脂酸(C16:0),硬脂酸(C18:0),油酸(C18:1),亚油酸(C18:2),亚麻酸(C18:3),二十碳烯酸(C20:1)和芥酸(C22:1)。在所有这些脂肪酸中，芥酸是食用油中不受欢迎的脂肪酸，因此也是影响油品质的一个关键因子。影响菜籽油的品质的另一个标准是C18不饱和脂肪酸的比率。增加油酸水平及降低多不饱和酸(亚油酸和亚麻酸)水平可以提高油的稳定性，减少深度油炸过程中不受欢迎物质的产生。最后，蛋白含量是饮食能量值的重要贡献成分，较高的蛋白含量可以提高油料种子的营养品质。

菜籽油是在菜籽的发育过程中积累的，是种子萌发和幼苗生长所需的重要碳源和能量储备。种子油的主要成分是三酰基甘油酯(TAGs)，既是人类必需的营养成分，也是重要的化工原料。TAGs通常由3-磷酸甘油和脂肪酸合成。在质粒脂肪酸主要由酰基辅酶A从头合成，整个过程由一系列的酶催化。酰基辅酶A羧化酶催化酰基辅酶A合成丙二酰基辅酶A，起始了脂肪酸合成反应。接着脂肪酸合成酶催化丙二酰基转移到酰基载体蛋白，导致C16-或C18-ACP的形成。形成的C16-或C18-ACP转移到细胞质，在脂肪酸脱氢酶的作用下合成不饱和脂肪酸，在脂肪酸伸长酶的作用下催化长链脂肪酸的合成。最后在内质网由3-磷酸甘油和各种脂肪酸酰基链形成TAGs。

前期的研究发现，一些调节基因(转录因子和蛋白激酶)参与了脂肪酸代谢的调节，表达这些基因的转基因植株显示了变更的脂肪酸代谢。除去这些调节基因，更多的是参与脂肪酸形成的结构基因。由于脂肪酸合成的酶大多数都已经被鉴定，编码它们的基因也在不同的物种里被克隆。其中一些关键的结构基因已被选择作为遗传操作的靶基因来改变脂肪酸的合成。

FAD2，编码脂肪酸脱氢酶2，催化油酸合成亚油酸。作为控制种子油中多不饱和脂肪酸的关键酶，FAD2被遗传抑制来提高油菜和棉花中油酸的比例。FAE1，编码脂肪酸伸长酶1，催化极长链脂肪酸伸长的浓缩步骤，也因此是芥酸合成的关键酶。抑制FAE1基因的表达能降低种子油中芥酸到极低水平，同时间接提高了种子中油酸含量。而增加FAE1基因的表达也能大幅提高种子油中芥酸的含量，后者是油脂化学工业中可再生的原材料。

中国发明专利申请(专利号CN200810186867.5)公开了在油菜中通过将FAD2和FAE1片段连接形成融合片段，再通过RNA干涉对融合片段进行沉默来提高菜籽油中油酸含量。该技术由于FAD2和FAE1基因干涉效率的变化，同时获得两个基因沉默效率都高的转基因株系有较大难度，获得的几率较低。同时会要求提供较多的转基因株系以供选择。这使得相关过程工作量加大，且具有一定的筛选难度。该项技术在一定程度提高了菜籽油中油酸含量，但是其对菜籽油品质(脂肪酸平衡和种子蛋白含量)的影响并没有公开。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种共抑制油菜FAD2和FAE1基因表达提高菜籽油营养品质的基因改良技术方法，该方法不仅提高了菜籽油中油酸含量，同时对提高C18不饱和脂肪酸相对比率和种子蛋白含量有促进作用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种共抑制油菜FAD2和FAE1基因表达提高菜籽油营养品质的方法，该方法包括以下的步骤：

1)质粒构建

1.1)种子特异性的RNA干涉载体构建，用引物(F:GAATTCCAGGTCTAAGCTTTCTTC，R:GTCGACTTGTTTGTATTGATGAGT)将napin A启动子从CY2基因组中扩增，并在EcoRI/XhoI位点克隆到pFGC5941载体中，获得pFGC5941NapinA构建；