[发明专利]一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用

权利要求书

1.一种基因敲除方法，其特征在于，包括：将Cas9基因插入到出发载体pSL1180的多克隆位点，得到中间载体，然后将完整的含有Cas9基因的表达盒IE1-Cas9-SV40插入到最终载体pBac[3×P3-EGFP]，得到重组表达载体pBac[3×P3-EGFP +IE1-Cas9-SV40]，将所述重组表达载体与辅助质粒混合，将混合液注射至蚕蛾的卵中，孵化得到G0代蚁蚕，蚁蚕羽化成蚕蛾，蚕蛾回交或自交，得到G1代蛾圈，取G1代蛾圈中阳性转基因系家蚕，培育至羽化，自交选纯，获得表达Cas9蛋白的转基因家蚕；将家蚕内源性脂肪酸去饱和酶基因BmDES3特异靶序列接入家蚕内源性U6启动子后，再将sgRNA序列连接至U6启动子，获得U6-sgRNA表达盒，将U6-sgRNA表达盒插入到载体pBac[3×P3-DsRed]，得到重组表达载体，将所述重组表达载体与辅助质粒混合，将混合液注射至蚕蛾的卵中，孵化得到G0代蚁蚕，蚁蚕羽化成蚕蛾，蚕蛾回交或自交，得到G1代蛾圈，取G1代蛾圈中阳性转基因系家蚕，培育至羽化，自交选纯，获得表达sgRNA的转基因家蚕；将表达Cas9蛋白的转基因家蚕与表达sgRNA的转基因家蚕杂交，获得共表达阳性个体；所述sgRNA序列如SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示，所述U6启动子序列如SEQ ID No.6所示。