[发明专利]一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法

权利要求书

1.一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下两部分：

第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：

步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；

步骤（2），分别配制0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：

天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

茶氨酸25μmol/L、50μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、1250μmol/L；

胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；

酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；

移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；

步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；

其中，仪器分离条件为：

色谱柱：XBridge C18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm）；柱温37℃；流速2.0mL/min；

荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；

流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；进样量10μL；

第二部分，测定茶叶鲜样中所述第一部分中的18种游离氨基酸含量，包括以下步骤：

步骤（1），样品制备；

取茶叶鲜样搅碎并混合均匀，向茶叶鲜样中加入沸水，所述茶叶鲜样与所述沸水的投入比为向每1g茶叶鲜样中投入40mL沸水，在88~92℃条件下浸提18~22min，冷却至室温后，2500~3500r/min离心4~6min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后得到茶鲜叶样品溶液；

步骤（2），对所述茶鲜叶样品溶液进行衍生化反应；

移取10μL茶鲜叶样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；

步骤（3），根据所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间对所述茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸定性，使用外标曲线法计算茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的含量；其中，测定茶鲜叶样品溶液中游离氨基酸的仪器分离条件与所述第一部分的步骤（4）中的仪器分离条件相同。

2.根据权利要求1所述的一种茶叶鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：在所述第一部分的步骤（2）中，0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取19.0g三水醋酸钠、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸调节pH至5.05，加EDTA，用0.45µm滤膜过滤；

0.4mol/L的硼酸盐缓冲液的配制方法为：称取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氢氧化钠溶液调节pH至8.8，然后加水稀释至500mL；

0.8mg/mL的AQC衍生液的配制方法为：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，涡旋混合，在55℃条件下加热至溶解。