[发明专利]一种鹿角胶中鹿、牛源性多重荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用

说明书

本发明公开了一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现龟甲胶中龟、牛源性成分的快速检测。本发明能够快速的检测到鹿角胶及其制品中鹿、牛源性，从而辨别真伪，具有重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗时短的特点。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种鹿角胶中鹿、牛源性多重荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。属于胶类中药动物源性检测技术领域。

背景技术

鹿角胶为鹿科动物梅花鹿（Cevusnippon Temminck）或马鹿（Cevusnippon elaphusl）的角经水煎煮、浓缩制成的固体胶，始载于《神农本草经》，称白胶，与阿胶并列为上品。在《本草逢原》中称为鹿胶，味甘、咸，性温，入肝、肾两经，具有温补肝肾，益精养血等功效。长期服用可以滋养强壮，补血止血，抗衰防老，适用人群广泛。

据2015年版《中国药典》记载，鹿角胶为鹿角经水煎熬、浓缩制成的固体胶，为单一来源的固体胶，不允许添加其他胶类。然而，由于鹿角胶的生产原料有限，价格昂贵，加上现行药典不能准确有效的检测出鹿角胶是否添加了其他胶原成分，因此假冒伪劣现象时有发生。有的生产企业为了降低成本，在鹿角胶生产加工过程中掺入其他动物的皮毛，包括廉价的猪皮、牛皮等。致使鹿角胶行业产品价格悬殊，质量参差不齐，真假难辨。若消费者长时间服用劣质鹿角胶，可能会对身体造成伤害，达不到相应的疗效。劣质鹿角胶产品的出现影响整个鹿角胶产业链的健康发展。这就要求发展更加可信、灵敏的检测技术来满足监管部门的治疗控制与监管的要求。

随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的危险，广泛应用于各个领域。

目前，对于鹿角胶的鉴定主要还是从多肽角度利用质谱定性检测，专利CN103630620A利用多肽差异性，通过加入限制性内切酶来检测鹿角胶中溯源鉴定。但这些方法均针对鹿角胶中多肽差异性进行鉴定，而由于技术的局限性，灵敏度和假阳性比率相对较高，判定上不够准确。因此，传统的鉴别方法不能完全满足当前鹿角胶真伪鉴别的要求。而利用实时荧光定量PCR检测鹿角胶中鹿、牛源性的研究目前在国内还尚未报道。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种鹿角胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测引物，其核苷酸序列如下：

正向引物UF序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；

反向引物UR序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQ ID NO.2所示。

一种同时检测鹿角胶中鹿、牛源性荧光PCR检测探针，包括：

鹿特异性探针LUP序列：5’-TAAGGAAACAACAACACTCTTTATGGG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

牛特异性探针NP序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT- 3’，如SEQ ID NO.4所示。