[发明专利]一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法

说明书

本发明公开了一种N‑糖酰胺酶活力测定的方法，包括如下步骤：(1)还原糖标准曲线的制备，(2)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应，(3)N‑糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定；并进一步优化了显色条件。本发明所公开的方法准确度高、重复性强、操作简便、适用于大规模筛选N‑糖酰胺酶的活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，属于酶活性检测方法领域，更具体地，本发明涉及一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法。

背景技术

N-糖基化蛋白质是目前存在最为广泛、作用最为重要的糖复合物类型，要了解糖基化的作用和意义，首先要对糖链的结构进行分析，而要对糖链的结构进行分析，则要先将糖链从蛋白质分子上释放下来。化学法释放糖链由于反应条件苛刻、过程不易控制、污染严重等问题而很少被人们采用。相比较而言，酶法具有反应条件温和、专一性和可控性强、没有污染等优点而受到人们青睐。N-糖链是迄今为止研究最为深入的糖基化类型，其原因之一是很早就找到了可以将N-糖链从蛋白质分子上释放下来的酶：N-糖酰胺酶，此类酶的发现使得对N-糖链的研究远远超过其他类型的聚糖。因此，找到功能强大的N-糖酰胺酶进行N-糖链的释放是糖生物学研究领域的重要技术环节，是开展其他后续研究的前提和基础。

迄今为止，见诸文献报道的N-糖酰胺酶共有20多种。目前市售的商业化N-糖酰胺酶主要有两种，分别是从甜杏仁(Prunus dulcis)提取的N-糖酰胺酶A(PNGase A)和来源于脑膜炎脓杆菌(Flavobacterium meningosepticum)由大肠杆菌表达的重组N-糖酰胺酶 F(PNGase F)。然而这两种酶都有一定的应用局限性，因此关于新型N-糖酰胺酶的挖掘工作从未停止。自N-糖酰胺酶发现至今，缺乏一个简单、快速、精确、适合高通量筛选的活性测定方法，一直是制约N-糖酰胺酶发现和改造的瓶颈。以往的试验主要是两种底物对N-糖酰胺酶的活性和酶动力学参数进行测定。一种是放射性同位素标记的糖肽作为底物，通过纸层析或电泳对底物和酶解产物进行分离后，并使用生物可视化分析仪进行定性或定量。但¹⁴C标记糖肽需在指定的地点和专用设备进行制备，局限性大且可能对操作者存在安全隐患。另一种底物是荧光标记底物，丹黄酰氯标记糖肽类底物，通过高效液相色谱将底物脱糖基化反应产物进行分离，检测方法更为灵敏和准确，可以达到皮摩尔水平。无论是放射性同位素底物或荧光标记底物都需要复杂的制备和纯化过程，包括多步的凝胶过滤和离子交换层析。而且现有的方法采用的是糖肽而非糖蛋白作为酶解反应底物，不能反映N-糖酰胺酶对糖蛋白的动力学参数，而糖蛋白才是主要的天然底物和作用对象。由于上述局限性，已报道的N-糖酰胺酶大多缺乏重要的酶动力学参数，从而使横向比较不同研究中所发表的酶活性高低成为难题。综上所述，本领域有必要开发和改进一种简单、快速、精确、适合高通量筛选的N-糖酰胺酶活性以及酶动力学研究方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确度高、重复性强、操作简便、适用于大规模筛选的N-糖酰胺酶活性检测方法。

本发明所述的一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，包括以下步骤：

(1)还原糖标准曲线的制备：将还原糖标准品稀释成一系列的浓度标准液，于各浓度标准液中加入三氯乙酸溶液、氢氧化钠溶液、WST-1显色溶液，混匀后40-60℃显色 50-60min，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，得到还原糖浓度与吸光度关系曲线；

(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应：将糖蛋白标准品用水稀释，加热变性，冷却后加入pH缓冲液和不同浓度的N-糖酰胺酶反应；

(3)N-糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定：步骤(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白反应液中加入三氯乙酸溶液终止反应，离心取上清液；加入氢氧化钠溶液，再加入WST-1溶液 40-60℃显色50-60min小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，反应零分钟为空白对照；根据吸光值与还原糖标准曲线可得到N-糖酰胺酶酶解产物浓度，从而计算酶活性。