[发明专利]一种重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法

说明书

本发明公开了一种重组人溶菌酶反相高效液相色谱分析方法，该方法以孔径20～50nm、粒径2～10μm的十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，既可以让重组人溶菌酶这种大分子蛋白在柱上有一定的保留时间，又不会让该蛋白与填料结合过强而导致无法洗脱；通过在流动相中添加氯化钠，从而保证在反相高效液相色谱分析过程中重组人溶菌酶的溶解性，使其能够与流动相完全混溶，保证了色谱峰的踏板数、对称性、重复性、定量分析的准确度，可用于重组人溶菌酶的分析与定量检测。

技术领域

本发明涉及一种重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法。

背景技术

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入柱内，当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由流动相带出，实现混合物中各组分的分离并依次进入检测器，检测由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

反相高效液相色谱法：流动相的极性大于固定相的极性，即以非极性键合相为固定相(常以十八硅烷C18、辛烷C8、甲基C1、苯基等作为固定相)；水或缓冲液，加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂为流动相用以分离检测相关物质的高效液相色谱法。

在生物医药及蛋白质检测分析领域，反相高效液相色谱法被广泛应用于目标物质的分析及定量检测。重组人溶菌酶这种蛋白质具有其特殊的理化性质，发明人发现用反相高效液相色谱法分析检测时存在以下问题：(1)重组人溶菌酶分子量为14000Da，分子量相对较大，用常用的反相C18柱分析经常出现蛋白与填料结合过强而导致无法洗脱，无法正常分析并且损毁色谱柱；(2)重组人溶菌酶为盐溶性蛋白，在100mM以上的氯化钠水溶液中溶解性良好，低于100mM的氯化钠水溶液中重组人溶菌酶溶液会呈现悬浊状态；常用的反相高效液相色谱的流动相中不使用高浓度的氯化钠，这将导致分析过程中重组人溶菌酶处于不完全溶解状态，即使有色谱峰也无法准确反映其量效关系，并且不完全溶解的蛋白也会损坏色谱系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种重复性和定量分析的准确度高的重组人溶菌酶的反相高效液相色谱分析方法。

解决上述技术问题采用的技术方案由下述步骤组成：

1、将重组人溶菌酶标准品溶解于质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液中，配制成重组人溶菌酶标准品溶液，采用反相高效液相色谱对标准品溶液进行分析，色谱分析条件：色谱柱为C18反相色谱柱，填料为孔径20～50nm、粒径2～10μm的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A是氯化钠质量浓度为0.9％、三氟乙酸体积浓度为0.1％的超纯水溶液，流动相B是乙腈与超纯水体积比为6:4的混合液且混合液中含有质量浓度为0.9％的氯化钠和体积浓度为0.1％的三氟乙酸，进行梯度洗脱，流动相梯度A:B由(90～0):(10～100)到(50～0):(50～100)，检测波长为280nm，流速为1mL/分钟；绘制色谱主峰面积随重组人溶菌酶浓度变化的标准曲线。

2、将待测重组人溶菌酶样品溶解于质量浓度为0.9％的氯化钠超纯水溶液中，用滤膜过滤，收集滤液，采用反相高效液相色谱对滤液进行分析，色谱分析条件与步骤1相同。

3、根据步骤2得到的色谱主峰面积，结合步骤1确定的标准曲线的线性方程即可得到待测重组人溶菌酶样品中重组人溶菌酶的浓度。

上述步骤1中，所述的流动相梯度优选0到30分钟A:B由55:45到5:95。

上述步骤1中，所述的填料优选孔径30nm、粒径5μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

本发明的有益效果如下：