[发明专利]一种提取大型真菌基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA的提取领域，具体涉及一种提取大型真菌基因组DNA的方法。

背景技术

大型真菌(macrofungi)是指能形成肉质或胶质的子实体的一类真菌，分为食用、药用、毒菌等几类。大型真菌是菌物中的一个重要类群，很多种类具有较高的营养价值和药用价值，是目前菌物中最有开发应用前景的一类。近年来，随着现代生物技术的快速发展，分子标记、基因工程等分子生物学技术广泛应用于大型真菌研究中，大型真菌的基因组DNA的提取、分离和纯化是关键的技术之一。大型真菌含有丰富的蛋白质和多糖，而蛋白质和多糖的存在会影响DNA的酶切、PCR反应和Southern杂交等实验。

目前，已有多种大型真菌的菌丝体及子实体提取DNA方法。吕作舟等(食用真菌基因工程实验技术[J].中国食用菌，1992，11(1)：13)报道了一种食用菌DNA提取的方法，但该法需要制备原生质体，耗时且提取的DNA得率低；Borroso G等(A miniprep method for RFLP analysis and dsRNAS detectiond perfected in the cutivated fungus Agrocybe aegerita.Science and Cultivation of Edible Fungi，1995，87-94)采用CTAB法提取蘑菇基因组DNA，但该法步骤繁琐，DNA得率低；杨同文等(CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒提取食用菌DNA[J].生物技术，2009，19(1)：32-34)建立CTAB结合DNA凝胶试剂盒提取食用菌DNA的方法，没有采用酚仿抽提和DNA晾干、再溶解等操作，但该方法成本较高；孙立夫等(一种高效提取真菌总DNA的方法[J].菌物学报，2009，28(2)：299-302)采用带有无菌塑料钻头的小型手动电钻进行研磨，提取了真菌DNA，但该方法耗时较长。中国专利ZL2010101628359和ZL2010101628452中提供了食用菌基因组DNA的提取方法，虽然这两种方法可以在较短时间内完成DNA提取，但是均未对提取的DNA进行后续的纯化处理，对于一些对DNA纯度要求较高的实验会造成不利影响。因此，亟需建立高纯度的提取大型真菌的子实体和菌丝基因组DNA方法，从而为大型真菌分子育种和基因工程提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取大型真菌的基因组DNA方法，利用该方法获得的基因组DNA具有较好的完整性，经琼脂糖凝胶电泳后染色，DNA条带清晰且单一，无拖尾，无杂带，获得的基因组DNA纯度高、产量高、操作简单、成本低，适用于各种大型真菌的子实体和菌丝的分子生物学研究。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提取大型真菌的基因组DNA方法，包括以下步骤：

1)破碎细胞

将大型真菌的子实体或菌丝在液氮中研磨，加入试剂Ⅰ，震荡，水浴，离心，取上清液；

其中，所述的试剂I中各组分及含量为：Tris-HCl 100～400mM，NaCl 100～400mM，EDTA10～40mM，SDS细胞裂解液0.3～0.6wt.％，乙烯聚吡咯烷酮0.1～1wt.％，pH＝7.7～8.0；

2)去除蛋白质、抽提基因组DNA

向步骤1)的上清液中加入试剂Ⅱ，混匀，离心，取上清液；

其中，所述试剂Ⅱ中按体积比含有苯酚：氯仿：异戊醇＝25：20～24：1～2；

3)沉淀、溶解基因组DNA

加入异丙醇，混匀，离心，舍弃上清，保留沉淀，再加入试剂Ⅲ，混匀，然后加入试剂Ⅳ，溶解所提取的DNA，混匀；

其中，所述试剂Ⅲ为灭菌蒸馏水或1×TE缓冲液；试剂Ⅳ中含有：异硫氰酸胍6～10M，Tris-HCl 20～60mM，EDTA 30～60mM，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)10～40mM；

4)纯化基因组DNA

将步骤3)的混合液移入核酸吸附柱中，静置，离心，提取物吸附至核酸吸附柱，弃滤液；向核酸纯化柱中加入试剂Ⅴ，离心，弃去滤液，再加试剂Ⅵ，离心，弃去滤液；

其中，所述的试剂Ⅴ包括异硫氰酸胍6～10M，Tris-HCl 20～60mM；试剂Ⅵ包括；Tris-HCl 20～60mM，NaCl 100～400mM，乙醇70～75vol％，体积分数；

5)洗脱基因组DNA

将核酸纯化柱安置于离心管内，离心，向核酸纯化柱中加入试剂Ⅲ，静置，离心，获得所述大型真菌基因组DNA。