[发明专利]在哺乳动物细胞中产生具有延长的循环半衰期的重组糖蛋白的方法

说明书

本申请是发明名称为“在哺乳动物细胞中产生具有延长的循环半 衰期的重组糖蛋白的方法”、申请号为“201280003817.3”、申请日为2012 年1月6日的申请的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明总体上涉及重组表达系统并且更具体地说涉及用于生物合 成具有增加的α2-6唾液酸含量的糖蛋白的方法。

背景信息

有机磷(OP)试剂抑制神经细胞中的乙酰胆碱酯酶(AChE)的能力使 得其能够用作杀虫剂、除草剂以及强有力的神经毒剂，包括Sarin、 Tabun、Soman以及VX。它们对胆碱能神经系统的神经毒性效应如果 没有得到适当地治疗则可能导致气哽感、视力丧失、唾液分泌过多、 胃痉挛、呕吐、腹泻、肌肉痉挛、失去意识以及死亡。反应的原因是 分解乙酰胆碱的能力的丧失，从而导致神经细胞的过度刺激。

因为暴露于OP代表未来的潜在的化学危险，所以可用于预防这些 化学品的试剂代表保护作战人员和平民免于化学中毒的一个重大机 遇。保护士兵以对抗OP试剂的一种手段是通过注射生物清除剂，所述 生物清除剂结合至这些OP试剂并且防止它们到达作用部位。

OP神经毒剂如sarin、soman以及VX代表我们的作战人员和平民 人群所面临的最危险的化学武器威胁中的一些，因为这些致死剂可以 由境外实体或恐怖组织生产。作为结果，这些试剂可以为与美国利益 相悖的组织所拥有。此外，如果这些试剂进行大面积地传播，那么所 述试剂有可能使数以千计的作战人员或平民致残、伤害或甚至杀死他 们。因此，预防它们的毒性的医疗措施将非常有助于预防或减轻由这 些OP神经毒剂所表现的毒性效应。OP-清除剂当用作保护性预防剂时， 在目前代表了用于预防由于在化学危险区中暴露于这些神经毒素而对 作战人员和平民所造成的伤害或使这种伤害减至最小的最佳替代品中 的一种。OP-清除剂的最可能的终端用户是在战争区的美国和盟军作战 人员，在所述战争区中存在暴露于此类化学神经毒剂的重大机会或危 险。第二种终端用户将是在美国保护下的平民，这些平民处在恐怖分 子或流氓政权的化学攻击的重大风险之中。

最有名的生物清除剂候选物之一是丁酰胆碱酯酶(BChE)，包括人 血浆丁酰胆碱酯酶(huBChE)。BChE是在人和其它动物中发现的胆碱酯 酶家族的天然血浆酶。BChE是具有约340kDa的分子量和在体内的持 续半衰期的四聚体丝氨酸酯酶。尽管huBChE的确切生理机能尚未知 晓，但这种酶可以预防暴露于OP化合物的动物中毒。在作为生物清除 剂的作用中，huBChE直接结合至神经毒剂，从而将其螯合以避免作用 于神经毒剂的乙酰胆碱酯酶主要目标。关于OP化合物的其它酶清除 剂，huBChE具有广谱活性和(如果有的话)有限的生理副作用。此外， 源自血浆的人BChE(huBChE)在体内具有处于数十小时范围内的持续 且较长的平均驻留时间。因此，施用外源huBChE代表一种用于预防 OP试剂对于所暴露个体的毒性的潜在宝贵策略。然而，这种生物清除 剂不能降解神经毒剂且作为结果，所述蛋白质清除剂要有效则需要近 似mg/kg体重的剂量。

huBChE可以从人血浆获得，然而，这种手段不是最佳的，因为很 难获得在可能的军事紧急状态下所需的较大量，特别是从血浆对于其 它未得到满足的医疗需求的重要性来看。因为huBChE在蛋白质与OP 试剂的1:1化学计量下对保护是有效的，所以要求足以适用于军事的量 的这种酶的替代来源。因此，生产大量有效的huBChE呈现为军事上 进行成功预防以抵抗作战人员对于OP神经毒素的暴露的一个主要障 碍。

已经对用于大规模生产rhuBChE的重组表达系统进行了探究，且 作为结果，所述蛋白质已经在包括大肠杆菌、哺乳动物以及转基因动 物的表达系统中表达。考虑到CHO源性产物在生物技术产业中的成功， 推断来自CHO且或许是其它哺乳动物细胞的rhuBChE也将有效作为 人血浆源性BChE的替代品。不幸的是在所有情况下，重组人BChE(rhuBChE)尚未同血浆源性huBChE一样有效，主要是因为循环半 衰期可能缩短了许多倍，从而产生了不能在战地长期发挥作用的试剂。 当前的rhuBChE无效的原因归咎于用于产生这种蛋白质的表达系统， 所述表达系统不具有产生特性与天然huBChE类似的产物所必需的合 成能力。由于作战人员可能有长期的潜在暴露，所以希望开发一种在 体内具有延长的循环半衰期的BChE生物清除剂。