[发明专利]一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法

权利要求书

1.一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：

步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20-30min，备用；

步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径4-6mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理20-30s，然后用无菌水冲洗4-6次，备用；

步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入到Chu10营养基或营养液中，编号、密封后放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养7-10d，观察其变化，其中所述Chu10营养液由如下组份的原料制成：3.67g/100mL CaCl₂·2H₂O溶液1份，3.69g/100mL MgSO₄·7H₂O溶液1份，1.26g/100mL NaHCO₃溶液1份，0.87g/100mL K₂HPO₄溶液1份，8.50g/100mL NaNO₃溶液1份，2.84g/100mL Na₂SiO₃·9H₂O溶液1份，3.35g/100mL的柠檬酸和3.35g/100mL的柠檬酸铁混合得到的柠檬酸铁溶液1份，微量营养素溶液1份，蒸馏水1000份，所述微量营养素溶液是由1000mL的蒸馏水中加入Na₂EDTA 50.0mg、H₃BO₃618.0 mg、CuSO₄·5H₂O 19.6mg、ZnSO₄·7H₂O 44.0mg、CoCl₂·6H₂O 20.0mg、MnCl₂·4H₂O 12.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O 12.6mg制备而成，所述Chu10营养基是由1000mL的Chu10营养液中加入15-20g的琼脂粉，加热溶解而成；

步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹4-5次，做好标记，放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；

步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度22-28℃、光照12h、黑暗12h的条件下以50-100r/min的转速摇床振荡培养7-10d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。

2.根据权利要求1所述的一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：步骤三中所述Chu10营养基装入到培养皿中，每个培养皿放5-8个病组织圆片，并在皿底记上编号，密封后对其进行培养。

3.根据权利要求1所述的一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：步骤四中所述藻类似物用蘸取无菌水的无菌棉签在病斑边缘刮取，然后涂布到Chu10固体培养基上。

4.根据权利要求1所述的一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：步骤三中所述Chu10营养液装入到三角瓶中，每个三角瓶放6-10个病组织圆片，在瓶身标号，密封后对其进行培养。

5.根据权利要求1所述的一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：步骤四中所述藻类似物用三角形玻璃涂布棒涂布到Chu10固体培养基上。

6.根据权利要求1所述的一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：步骤五中所述藻类病原转接到装有Chu10营养液的耐高温带无菌透气膜瓶盖的PC组培瓶中，进行摇床振荡培养。

7.根据权利要求1所述的一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：步骤五中所述藻类病原转接到装有Chu10营养液的试管中，用无菌透气封口膜封住管口，膜用细线绑定，进行摇床振荡培养。