[发明专利]肺癌miRNA检测的内参基因的鉴定

说明书

本发明公开了在肺癌病人中稳定表达的内参miRNA基因，包括hsa‑miR‑345‑5p或者hsa‑miR‑345‑5p和hsa‑miR‑99b构成的组合。该内参基因可以用于肺癌病人miRNA检测中目标基因的标准化，可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。

技术领域

本发明专利涉及到一种用于肺癌miRNA检测的内参miRNA基因的鉴定。

背景技术

肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，在中国，肺癌的发病率逐年升高，死亡率也是位居肿瘤死亡首位。据世界卫生组织(WHO)估计，截至2025年，我国每年肺癌死亡病例将达到100万。近年来，尽管肺癌的诊断和临床治疗已取得很大进展，但患者的总生存时间仍很短，5年生存率不超过15％。目前的治疗手段对肺癌总生存率的提高效果不大，II-IV期肺癌患者5年生存率大约在40％-5％之间，而I期患者5年生存率可高达92％。

已经证实，miRNA在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性。并且miRNA在外周血中的表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，同时与RNA比较，其表达稳定性更为显著。研究表明通过检测血浆或血清中的miRNA以诊断肺癌可能是可行的、稳定的及具有可重复性的研究方向。

在基因表达研究中有各种因素可导致样品偏差，比如RNA的数量和质量，但是表达数据能通过内参基因的校正来修正这种偏差。miRNA内参基因的选择非常重要。有研究表明，内参基因的选择可对RT-PCR结果产生显著影响，若内参基因选择不恰当，将使样本间的基因表达差异被掩盖或者过度夸大，导致出现错误甚至与事实相反的结论。此外，由于miRNA的特异性表达与肿瘤类型密切相关，因此在选择内参基因时需考虑肿瘤类型、样本来源以及实验方法等因素，以针对性地选择合适的内参基因。近年来出现了用人工合成的非人类(如线虫)miRNA作为miRNA检测标准化的外源性对照，但是，外源性对照不能纠正样本采集的差异，所以并不是理想的选择。同时，一些内源性基因常被用作组织/细胞miRNA检测的内参基因，比如5SrRNA、18SrRNA和U6等，但是由于这些基因不是miRNA，不能代表miRNA的组分，而且这些基因的提取、反转录和PCR扩增的效率可能与miRNA有所不同。因此，这些基因也不是最理想的选择。目前尚无研究对肺癌研究中miRNA标准化的最佳参照基因进行系统性的鉴定和评估，因此，本领域迫切需要开发能够作为肺癌研究中microRNA标准化的参照基因，并建立检测miRNA，特别是循环miRNA的有效标准化方案。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种肺癌miRNA检测的内参miRNA基因的鉴定。

具体地，本发明提供一种miRNA在制备用于肺癌miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述miRNA为hsa-miR-345-5p。

本发明还提供一种miRNA的组合在制备用于肺癌miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述组合为hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b构成的组合。

其中hsa-miR-345-5p的序列为：5’-GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC-3’，hsa-miR-99b的序列为：5’-CACCCGUAGAACCGACCUUGCG-3’。

本发明还提供用于肺癌miRNA检测的内参试剂在制备诊断肺癌的试剂盒中的应用。提供一种诊断肺癌的试剂盒，该试剂盒含有用于检测内参miRNA hsa-miR-345-5p或者hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b的组合的试剂。

进一步地，所述试剂盒还包含用于miRNA提取及qRT-PCR反应所需的RNA分离液、试剂和酶，以及标准品或/和对照品。

本发明还提供一种检测肺癌患者血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；