[发明专利]一种桃叶卫矛茎尖超低温保存方法在审
申请号: | 201710239317.4 | 申请日: | 2017-04-13 |
公开(公告)号: | CN106993609A | 公开(公告)日: | 2017-08-01 |
发明(设计)人: | 宋红;李享;苏晴 | 申请(专利权)人: | 东北林业大学 |
主分类号: | A01N3/00 | 分类号: | A01N3/00 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 150040 黑龙*** | 国省代码: | 黑龙江;23 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 桃叶卫矛茎尖 超低温 保存 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种茎尖长期保存方法,具体是一种桃叶卫矛茎尖超低温保存方法。
背景技术
桃叶卫矛,又名白杜、丝绵木,是卫矛科卫矛属的一种小乔木,是我国常见的观赏类庭园树种之一,其叶形秀丽,植株繁茂,包被有红色假种皮的果实可长期宿存于枝头,到了冬季,白雪红果相映,十分美丽,为冬季的北方园林增添了不少色彩。桃叶卫矛在耐寒、抗旱、抗风等方面具有良好的适应性;桃叶卫矛果实总皂苷对人肝癌细胞系-SMMC、人宫颈癌细胞系-HeLa和乳腺癌细胞系-MCF7有明显的抑制生长作用;桃叶卫矛的种子含丰富的脂肪类物质,含油率高达40%以上,可用做工业用油;木材细腻坚韧,可用于雕刻、制帆杆或滑车等;种子及根药用,可用于治疗膝关节痛、漆疮等疾病。由此可见,桃叶卫矛是一种集工业、药用、观赏应用于一体的植物,具有较高的推广价值。若采用传统的种植保存,极易使其受到病菌或虫害的影响,进而造成极大的人力财力的损失,由于茎尖具有良好的分生能力,因此目前已经广泛地将其应用于植物种质资源的离体保存。
植物种质资源超低温保存是指将植物细胞、组织或器官在液氮(-196℃)的超低温条件下进行保存。在如此低的温度下,植物材料中参与新陈代谢的各种生物酶的活性受到极大抑制,生物体新陈代谢基本停止,处于“假死”状态,利用该方法可以实现植物种质资源的永久保存。目前成功进行超低温保存的材料类型有种子、休眠芽、茎尖分生组织、花粉、合子胚(胚轴)、体细胞胚、悬浮细胞、愈伤组织、原生质体等。而较于植物的其他部位,顶端分生组织具有更强的分生能力,而当茎尖经过超低温保存后依然能够保持较强的分生能力,因此茎尖也是超低温保存的首选材料之一,因此已经广泛应用于植物种质资源超低温保存。
将超低温保存技术应用于茎尖保存,其优点:操作简单易行、占用空间小、安全稳定保存成本低同时还能很好服务于育种工作,还可以避免病虫害的引入,为地区间、国际间的种质交换提供方便。
桃叶卫矛茎尖超低温保存目前还未见报道。因此,研发一种适合于桃叶卫矛茎尖的可行的超低温保存方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
本发明涉及一种桃叶卫矛茎尖玻璃化超低温保存的方法,依次包括:桃叶卫矛茎尖的剥离、茎尖预处理、装载、PVS2玻璃化处理、液氮保存、解冻和卸载以及恢复培养的方法。
优选地,所述的桃叶卫矛茎尖的剥离具体是指:在无菌条件下,从生长健康的无菌桃叶卫矛组培苗上剥取的茎尖长度为2~3mm的离体茎尖。
优选地,所述的预处理是指:将剥离后的茎尖放入预培养液中处理,预培养液中蔗糖最适浓度为0.4mol/L的MS盐溶液,于环境条件为25℃的人工气候箱中暗培养2d。
优选地,所述的装载具体是指:将预培养后的离体茎尖转接于装载液中,于室温下装载10~30min;所述的装载液的组成为:2M甘油+0.4M蔗糖的MS盐溶液。
优选地,所述的玻璃化处理具体是指:将装载后的茎尖放入100%PVS2玻璃化溶液于0℃条件下处理30min;所述的PVS2玻璃化溶液的组成为:MS盐溶液+30%甘油+15%乙二醇15%+15%二甲基亚砜+0.4M蔗糖。
优选地,所述的液氮保存是指:将PVS2溶液处理后的茎尖换上新的PVS2溶液,然后迅速将冷冻管浸入液氮中,至少冷冻1h以上。
优选地,所述的解冻和卸载是指:将液氮保存后的冷冻管取出并于40℃水浴中化冻70s,再将冷冻管转至超净工作台上用卸载液洗涤20min;所述的卸载液的组分为:MS盐溶液+1.2M蔗糖。
优选地,所述的恢复培养具体是指:将卸载液洗涤后的茎尖接种在恢复培养基上进行恢复培养;所述的恢复培养基为MS+6-BA1.0mg/L;所述的恢复培养条件为:先在25℃人工气候箱中暗培养7d,然后转入组培苗培养室进行培养。
与现有技术相比,本发明存在以下有益结果:
本发明的一种桃叶卫矛茎尖超低温保存的方法,是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存桃叶卫矛优良种质资源的方法,超低温保存后桃叶卫矛茎尖成活率高达70%;本发明以不定芽茎尖为超低温保存材料,一方面取材方便,另一方面由于茎尖含有茎尖分生组织,细胞再生能力较强,遗传稳定性高。
附图说明
图1为本发明实施例3中桃叶卫矛茎尖长度对超低温保存后茎尖成活率的影响
图2为本发明实施例4中预培养液蔗糖浓度对超低温保存后茎尖成活率的影响
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