[发明专利]高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种新型高灵敏的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。

背景技术

据世界卫生组织报道，世界上有超过20亿人感染过乙肝病毒，其中有4亿人患有慢性乙型肝炎(HBV)，HBV感染已成为最显著的公共健康问题。目前在中国，约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙肝患者约2000万例。HBV属于肝脱氧核糖核酸病毒科，在电子显微镜下显示为直径42nm的小圆颗粒，称为丹氏颗粒。丹氏颗粒由包膜和核心两部分组成，包膜含有表面蛋白、糖蛋白和细胞脂肪；核心含核心蛋白、HBV基因组DNA和HBV DNA多聚酶。HBV基因组为部分双链环状DNA，较长链通常含有3182个核苷酸而较短链含1700-2800个核苷酸。HBV全基因组DNA包含四个相互重叠的开放阅读框，编码四种具有特殊结构和功能的蛋白质。

HBV病毒侵入人体后，与宿主细胞上的特异性受体结合，脱去包膜，进入宿主细胞质内，脱去核衣壳，部分病毒基因组DNA进入并整合至宿主细胞核内，进一步反转录成mRNA进入宿主细胞质，，并在HBV DNA逆转录酶的作用下逆转录合成病毒负链DNA，负链DNA在HBV DNA聚合酶作用下合成正链DNA，这样就完成了HBV基因组DNA的复制，形成了子代的部分双链环状DNA；最后和相关蛋白装配成完整的病毒颗粒，释放至宿主细胞外，由此完成病毒粒子的复制。在基因复制过程中会自发地或由免疫诱导产生突变，突变会随着时间累积，因此相对于其他DNA病毒而言，HBV基因组变异程度更大。

目前，世界上主要存在8种HBV亚型，即HBV基因型A-H，不同基因型之间全基因组序列差异不少于8％或S基因差异不少于4％。在中国人群中出现的主要是A-D型HBV，其中以B、C、D型为主，A型较少见，且存在地区分布差异性。对于长期感染HBV的患者来说，若不加以干预，在慢性HBV患者几十年的发展历程中，有15％-40％的患者会发展成为肝硬化、晚期肝脏疾病、肝细胞癌或需要进行肝脏移植。在输血过程产生的漏检也是HBV感染的重要途径，因此，乙肝病毒的检测对于乙肝病毒感染的预防、诊断和治疗具有举足轻重的关键作用。

HBV病毒核酸遗传基因序列中的主要有四个开放阅读框(ORF)，分别称为S(ORF S)、C(ORF Core)、P(ORF P)及X(ORF X)，能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为S基因和前S基因，其中S基因能编码主要表面蛋白，前S基因能编码PreS1和PreS2蛋白。C区基因包括：前C基因，编码e抗原(HBeAg)；C基因，编码核心抗原(HBcAg)。其中S基因和C基因是保守型较高的序列区域，因此在检测中常以此序列为目标进行检测，已达到覆盖不同分型的目的。

本方法中分别针对乙型肝炎病毒核酸的S基因和C基因的两段保守序列作为靶序列，并通过引入内定量参考品(QS)，无需制备标曲即可实现样本的准确定量，可实现对HBV DNA的高灵敏实时荧光定量检测，不仅避免了实际临床样本中由于S基因或者C基因的丢失造成的假阴性结果，还能够通过高度一致内定量参考品(QS)对检测样本进行定量，无需外对照，避免了检测反应管间的差异，使整个检测过程更加便捷。目前尚无一种方式采用该方式完成乙型肝炎病毒核酸高灵敏定量检测。

发明内容

基于此，本发明的目的之一为提供一种更为简单、更有保证的高灵敏乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒，以实现避免实际临床样本中由于S基因和/或者C基因的丢失造成的假阴性结果。

实现上述目的的技术方案如下。

一种乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒，包括有针对S基因的引物和探针，所述引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述探针为SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，和SEQ ID NO.11，其中，碱基组成如SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8或其反向互补序列所示探针的末端标记有荧光。

一种乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR检测试剂盒，包括有针对C基因的引物和探针，所述引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，所述探针为SEQ ID NO.6,SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.10，和SEQ ID NO.12，其中，碱基组成如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，或其反向互补序列所示探针的末端标记有荧光。