[发明专利]一种能同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针

说明书

本发明公开了一种能同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的检测试剂盒及引物和探针。所述引物和探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14所示。本发明还公开了快速、准确、使用方便的同时检测和鉴别口蹄疫和水泡性口炎的一步法多重荧光RT‑PCR检测试剂盒。本发明的检测方法可以实现一次采样，一次分析，可同时检测和区分3种重要病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。

技术领域

本发明涉及一种可同时检测和鉴别口蹄疫病毒(FMDV)、新泽西水泡性口炎病毒(VSV-NJ)和印第安型水泡性口炎病毒(VSV-IND)的一步法多重荧光RT-PCR检测试剂盒及引物和探针，可实现一次采样，一次分析，同时检测和区分3种病毒的目的，属于检验检疫领域。

背景技术

口蹄疫病毒(FMDV)和水泡性口炎病毒(VSV)是引起牛、羊、猪等多种动物感染的病毒性疾病，临床特征均为口腔粘膜、乳头皮肤及蹄冠部皮肤出现水泡及糜烂，会混合感染，临床症状相似，鉴别诊断困难，是危害养殖业最为严重的几种病原。口蹄疫和水泡性口炎被世界动物卫生组织(OIE)规定为多种动物感染的、跨界传播病原，也是我国动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象。

目前，针对上述几种病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要作用。但目前所建立的方法多是针对一种病原的单目标检测，在实际检测中需要重复多次，才能完成检测不同病原的目的，检测工作量大且时间长，不能满足大批量动物检疫快速通关的实际需要。且难以实现实际样品中大量存在的混合感染以及症状相似疫病的鉴别诊断。在建立单目标病原检测技术的同时，各国兽医机构也相继研制了可同时检测多种病毒的多重PCR，但传统PCR技术灵敏度低、结果不易判定等缺点限制了其在多重检测中的应用。

本研究利用荧光PCR技术在核酸检测方面具有的特异、敏感等特性，建立了FMDV、VSV-NJ、VSV-IND三种病毒一步法多重荧光RT-PCR检测和鉴别方法并组装成试剂盒，可以实现一次采样，一次分析，可同时检测和区分3种重要病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。

发明内容

本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的同时检测和鉴别口蹄疫病毒(FMDV)、新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)和印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IND)的多重荧光RT-PCR引物和探针。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的同时检测和鉴别口蹄疫病毒(FMDV)、新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)和印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IND)的一步法多重荧光RT-PCR检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

在序列比对分析的基础上，针对口蹄疫病毒3D基因、新泽西型水泡性口炎病毒L基因和印第安纳型水泡性口炎病毒L基因，分别设计并筛选出能覆盖大部分分离株(特别是口蹄疫的引物和探针能够实现7个血清型通用检测)，又适合多重检测并能进行鉴别的引物和探针(序列见表1)。口蹄疫病毒(FMDV)各血清型通用检测引物对由2条正向引物、3条反向引物和2条探针组成，新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)引物对由2条正向引物、1条反向引物和1条探针组成，印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IND)引物对由1条正向引物、1条反向引物和1条探针组成，多重反应体系中引物混合物是这10条引物组成的混合物，探针是这4条探针组成的混合物，经过一步法多重荧光RT-PCR反应，可以实现三种病原的同时检测和鉴别。

表1口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒(包括新泽西型和印第安纳型)的一步法多重荧光RT-PCR检测引物和探针