[发明专利]胞内表达热带假丝酵母脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备及其应用

说明书

本发明属于生物工程领域，提供了一种胞内表达热带假丝酵母脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂的制备方法：一个经过密码子优化的热带假丝酵母脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母GS115中进行胞内表达，经过初筛和复筛后得到最佳重组菌株3‑1；将重组菌株3‑1用5％的十六烷基三甲基溴化铵进行通透化，冷冻干燥后得到胞内表达热带假丝酵母脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂。本发明还提供了该胞内表达热带假丝酵母脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂在合成6‑O‑丁酰澳栗精胺中的应用方法：以四氢呋喃、澳栗精胺、丁酸乙烯酯和胞内表达热带假丝酵母脂肪酶的毕赤酵母全细胞催化剂为原料，在30℃、160r/min条件下进行合成反应。这两种方法简单高效，适于工业应用。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及经过密码子优化的热带假丝酵母脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母GS115中表达、优化表达条件、毕赤酵母全细胞催化剂的制备及其在合成澳栗精胺衍生物中的应用。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)属于α/β水解酶家族，它能催化水解、酯化、酯交换、酸解、醇解、氨解等多种反应，在食品、洗涤、制革、饲料、制药、能源等领域应用广泛。脂肪酶的来源主要有植物、动物和微生物，其中微生物脂肪酶具有催化活性多样性、稳定性好、高产量、可批量生产等优点，因此微生物脂肪酶的应用更为广泛。据估计，细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属的微生物均可产脂肪酶。来源于洋葱伯克霍尔德菌、荧光假单胞菌、米黑根毛霉、疏棉状嗜热丝孢菌、皱褶假丝酵母和南极假丝酵母的脂肪酶是目前常见的商品脂肪酶。

全细胞生物催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化的过程，生物催化中常用的有机体主要是微生物，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化。目前，全细胞生物催化已成功应用于谷胱甘肽、L-甘油醛、(2R,5R)-己二醇、L -二羟苯丙氨酸、抗坏血酸-2-磷酸、烟酰胺、CDP-胆碱、羟脯氨酸等物质的制备。澳栗精胺是从栗豆树种子中提取的一种多羟基氢化中氮茚生物碱，1993年Hempel等人用X-射线衍射方法解析了澳栗精胺的结构，它具有抗癌、抗病毒等生理活性，并且比其他生物碱抑制α- 葡萄糖苷酶的活性更强。八十年代以来，各国科学家在澳栗精胺全合成、生理作用以及药效等各个方面进行大量的研究。然而澳栗精胺也会抑制肠道内的蔗糖酶，从而引起渗透性腹泻。但是，6-O-丁酰澳栗精胺能增加亲油性并且对肠道内的蔗糖酶抑制作用减小，因此对胃肠道毒性小。6-O-丁酰澳栗精胺的抗病毒活性比母体化合物高30倍，它无论在试管中还是在体内对许多病毒都显示出较强的抗病毒活性，这些病毒包括HIV-1、HSV-1、HSV-2和牛病毒性腹泻病毒。由于澳栗精胺上存在四个十分相近似的仲醇基而使得在6-位的选择性单酰化作用十分困难。P.S.Liu等人用选择性保护和去保护的方法合成了6-O-丁酰澳栗精胺。从澳栗精胺起始一共需要5步反应(Synthesis of potent anti-HIV agents:Estersof castanospermine, Tetrahedron Lett.,1990,31(20):2829-2832)。W.K.Anderson等人用一步合成方法制备6-O-丁酰澳栗精胺，他们用甲醇中二丁基锡氧化物处理澳栗精胺，然后将反应加热至回流后冷却，并用酰基氯和三乙胺处理，急骤层析后得到澳栗精胺的6-O-单酯的游离碱，产率在18％-44％范围内(A facile selective acylation ofcastanospermine,Tetrahedron Lett.,1990,31(2):169-170)。D.L. Delinck等人用枯草杆菌蛋白酶在吡啶中催化合成了一些澳栗精胺的衍生酯类物质 (Enzyme-catalyzedacylation of castanospermine and 1-deoxynojirimycin Tetrahedron Lett.,1990,31(22):3093-3096)。然而在以往的研究中，尚无利用全细胞生物催化合成6-O-丁酰澳栗精胺的报道。

发明内容