[发明专利]一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用

说明书

本发明公开了一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用，属于生物催化技术领域。本发明构建了一株表达羟基化酶的重组菌，并进一步建立转化羟基氨基酸的高效共性的反应体系。本发明在发酵与转化耦联的反应体系中，利用重组大肠杆菌催化底物L‑脯氨酸，获得产物反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。通过优化重组酶的活性表达和调控转化过程来强化产物合成，将菌体细胞接入发酵体系37℃培养3h后，变温为20℃诱导培养60h，将温度转为30℃反应20h，得到产物反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸，产率达到95.8％。与粗酶和全细胞转化体系相比，处理相对简单，节约了时间和劳动成本，因此该重组大肠杆菌的发酵转化耦联系统是一种高效的生物催化系统。

技术领域

本发明涉及一种表达羟基化酶的重组菌及其在耦联合成羟脯氨酸中的应用，属于生物催化技术领域。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸的化学结构为：

反式-4-羟基-L-脯氨酸是一种稀有亚氨基酸，在医药保健方面可以作为重要的医药中间体来合成消炎药、碳青霉烯类抗生素等；在材料化工方面作为一种手性合成元件，用来合成聚酯碳酸、N-烷基吡咯、N-芳香基吡咯、(1S,4S)-2-氧杂-5-氮杂双环庚烷以及生物碱TAN1251A]等具有高附加值的产品；在食品营养和护肤美容方面也具有广泛的应用价值。

目前，国内生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法主要是生物组织提取法，然而从明胶或骨胶中利用酸水解的方法提取羟脯氨酸有诸多弊端，在当今提倡节能环保、绿色生产的政策下，微生物合成法的优点却越来越明显。

Lawrenced等从Streptomyces griseoviridusP8648中纯化出脯氨酸-4-羟化酶，并对该酶的特性进行了初步研究，但此酶的表达量较低，每毫克蛋白每分钟的羟脯氨酸产量仅为907pmol/L。刘合栋等将优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因插入含有色氨酸串联启动子的pUC19质粒，构建重组质粒pUC19-ptrp2-Hyp，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中。在摇瓶水平，重组菌以L-脯氨酸(200mM)为底物发酵8h，可积累(0.492±0.034)g/L的反式-4-羟脯氨酸，产物转化率仅达到1.9％左右，产物转化率过低。微生物合成法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的过程中，现有基因工程菌多以大肠杆菌为出发菌株，在摇瓶水平以脯氨酸为底物发酵生产羟脯氨酸的过程中，菌体生长缓慢，很难达到高密度发酵，脯氨酸的有效转化率较低，从而造成生产原料的浪费。

虽然已有许多开展生物催化转化羟基脯氨酸研究的相关报道，但能够羟基化L-脯氨酸的资源仍然有限，且在以游离L-脯氨酸为底物时，底物脯氨酸的消耗率较低，羟脯氨酸的产率较低，有必要进一步开发新的羟基化酶，探索更经济的生物转化条件。

发明内容

本发明的目的是构建一种表达羟基化酶的重组菌，以及该重组菌在耦联合成羟脯氨酸中的应用。本发明目的不仅仅在于构建一种表达羟基化酶的重组菌，并实现其在合成羟脯氨酸中的应用，从表达和转化过程耦联强化产物合成，进一步建立转化羟基氨基酸的高效共性的反应体系。

本发明第一个目的是提供一种表达羟基化酶的重组菌，所述重组菌表达了编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述羟基化酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的基因载体为pET28a。

本发明第二个目的是提供一种表达羟基化酶的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

1)将核苷酸序列为SEQ ID NO：1的基因K1连接到载体pET28a，得到重组质粒pET28a-K1；