[发明专利]一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物及应用

说明书

本发明提供了一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物及应用。该引物包括NNV‑CPF4：5’‑CCAATGACGTCCATCTCTCAGGTATG‑3’，NNV‑CPR3：5’‑CACTAGGGAACCGGATGACCC‑3’；GIV‑CP287F：5’‑GGCTCGGCGCAAACGGTACC‑3’和GIV‑CP605R：5’‑GGCAACACTACGGTGGGCAGAG‑3’。本发明的引物不仅可以检测石斑鱼上的NNV和SGIV病毒，还可以检测石斑鱼GIV和其它鱼类中的NNV，以质粒为检测对象双重PCR最低能检出RGNNV和SGIV的量分别为20 pg和0.125 pg。

技术领域

本申请属于水产病毒检测技术领域，具体涉及一种同时检测石斑鱼NNV和SGIV病毒的双重PCR引物及应用。

背景技术

石斑鱼属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)的一类鱼类总称，主要在我国广东、海南、广西、福建、浙江等沿海一带养殖，是我国南方渔民重要的经济来源之一。随着网箱高密度精养实验取得成功，石斑鱼养殖产业已渐成规模，但是石斑鱼的各种病害随着养殖规模的扩大呈迅速上升趋势。石斑鱼病害发生频繁，经常造成大面积鱼苗死亡，成鱼死亡率也很高，给养殖业带来巨大损失，严重制约我国南方石斑鱼产业的发展。由于病毒寄生在寄主的细胞内，所以病毒病是鱼类疾病中最难以治疗的一类疾病，至今尚无理想的治疗方法，主要是以预防为主。已有研究表明，在世界各地养殖石斑鱼中引起病毒病的主要是诺达病毒科的神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)和虹彩病毒科的虹彩病毒(Iridoviruses)这两种。

为了防止石斑鱼病毒病的发生和蔓延，确保石斑鱼育苗不带病毒是整个石斑鱼产业生产中的最为重要的一环。加强对鱼苗早期病毒的检测，就能够从源头上有效地控制病毒的扩散，确保石斑鱼养殖的安全，因此对石斑鱼鱼苗病毒的检测技术和方法就成为了病毒控制的关键点。赤点石斑鱼神经坏死病毒(Redspotted grouper nervous necrosisvirus,RGNNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是感染我国南方石斑鱼的两个最主要的病毒。赤点石斑鱼神经坏死病毒是罗达病毒科(Nodaviridae)β-罗达病毒属(Betanodavirus)的成员之一，而新加坡石斑鱼虹彩病毒则属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员。目前，受NNV感染的鱼类主要包括鳗鲡目、鳕形目、鲈形目、鲽形目和鲀形目等10目33科50余种。根据病毒衣壳蛋白序列可分为5种血清型，即赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosisvirus,RGNNV)、条斑星鲽神经坏死病毒(barfin flouder NNV，BFNNV)、黄带拟鰺神经坏死病毒(striped jack NNV，SJNNV)、大菱鲆神经坏死病毒(turbot NNV，TNNV)和红鳍东方鲀神经坏死病毒(tiger puffer NNV,TPNNV)。所有石斑鱼分离的NNV都属于RGNNV血清型。

根据前期对海南省石斑鱼养殖基地病毒病普查的基础上，发现RGNNV和SGIV经常复合侵染，给水产养殖业造成了严重的经济损失。已有许多文献报道用PCR或RT-PCR的方法来检测石斑鱼病毒病原，但是它们都是针对单个病毒来检测，未开展同时检测RGNNV和SGIV的技术或方法。由于目前缺乏有效的疫苗和治疗药物，因此快速、灵敏和同时检测2种病毒病原对预防这两种病毒感染尤其重要。其次，由于NNV病毒序列有一定的变异性，目前还未有报道利用NNV保守引物来检测多种NNV病毒。再次，与单个PCR相比，双重PCR设计的引物需要有更高的特异性，如引物之间不能有匹配或形成二聚体、退货温度不能差距过大、假阳性或非特异扩增、PCR产物的长度及在耙序列内位置选择等。因此，申请人通过对RGNNV和SGIV的序列设计引物，发明了一种简单、灵敏且能同时检测RGNNV和SGIV的双重PCR检测技术和方法，具有很高的实用价值和应用前景。

发明内容