[发明专利]检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法及其应用

权利要求书

1.一种检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被酶标板、洗涤液、血清稀释液、底物显色液、兔抗鸡酶标二抗、终止液、FAVⅠ标准阳性血清和FAVⅠ标准阴性血清；其中，所述包被酶标板是以Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ的重组六邻体蛋白作为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ的重组六邻体蛋白的核苷酸序列表为SEQ.ID.No.1。

3.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ的重组六邻体蛋白的制备方法包括：

设计合成引物，以Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠ代表株鸡胚致死孤儿病毒基因组为模板，通过PCR扩增得到六邻体蛋白的扩增产物，所述扩增产物连接其表达载体并同时进行双酶切,然后连接，构建重组质粒；将挑选的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得阳性重组质粒单克隆菌，所述阳性重组质粒单克隆菌在IPTG诱导下进行蛋白表达得到诱导产物，所述诱导产物依次经裂解沉淀、纯化及六阶段梯度复性后得到重组六邻体蛋白；其中，所述合成引物为：

上游引物：5'-CGCGGATCCATGACTGCGCTTACTCCCGA-3'，

下游引物：5'-CCGCTCGAGCCGCTCGAGCGCCAGCATGTACTGGTAAC-3'。

4.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.4。

5.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述血清稀释液为含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为过氧化氢的四甲基联苯胺溶液。

6.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述终止液为2M硫酸溶液。

7.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述包被抗原的包被浓度为5.0μg/mL；所述包被酶标板经含50g/L脱脂奶粉的PBST封闭，装入密封袋中置于4℃保存。

8.根据权利要求1所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于,所述兔抗鸡酶标二抗的稀释倍数为1:5000。

9.权利要求1-8任一项所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

用血清稀释液以体积比1：200的比例稀释待检血清得到稀释血清；

向96孔酶标板每孔中加入100μ所述稀释血清，向酶标板各添加两孔FAVⅠ标准阳性血清和FAVⅠ标准阴性血清作为对照，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，再向每孔加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μL以体积比1:5000稀释后的兔抗鸡酶标二抗，于37℃孵育1h，弃去反应孔中液体，向每孔中加入300μL洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

向96孔酶标板每孔中加入100μL底物显色液，室温下避光作用10分钟；

向96孔酶标板每孔加入100μL终止液以终止显色反应；

用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度(OD)值；

根据OD值判定，当OD₄₅₀值≥0.322时，判定FAVⅠ抗体水平为阳性，当OD₄₅₀值＜0.322时判定FAVⅠ抗体水平为阴性。

10.权利要求1-8任一项所述的检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒在检测Ⅰ群禽腺病毒抗体中的应用。